Sequenciamento de exoma clínico

As novas tecnologias de sequenciamento, denominadas de tecnologias de sequenciamento de nova geração, começaram a ser comercializadas em 2005 e estão evoluindo rapidamente. Todas promovem o sequenciamento do ácido desoxirribonucleico (DNA) em plataformas capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida. Essas novas plataformas possuem como características comuns um poder de gerar informação muitas vezes maior que o sequenciamento de Sanger, com uma grande economia de tempo e custo por base para o sequenciamento.

> Sequenciamento de gene único

É a forma mais comum de teste genético utilizada atualmente. Permite testar uma mutação em um gene específico que é conhecido por estar associado a uma determinada doença. O clínico deve determinar o distúrbio mais provável e solicitar o teste para o gene (ou genes) específico(s).

A técnica amplamente empregada é o sequenciamento de Sanger, que é capaz de sequenciar porções de DNA em segmentos curtos.

Consegue detectar a maioria das mutações comuns que afetam as sequências codificadoras, como mutações pontuais missense e nonsense, pequenas inserções/deleções e mutações nas junções de splicing. No entanto, não é capaz de identificar grandes inserções/deleções, variações do número de cópias (CNVs) ou expansões de repetições de nucleotídeos.

A principal limitação desta técnica é custo e o trabalho aumentado quando se tenta sequenciar grandes ou numerosos genes.

> Sequenciamento de multigenes

Para distúrbios neurológicos clinicamente heterogêneos, laboratórios comerciais desenvolveram painéis genéticos de tamanhos variados para testar múltiplos genes simultaneamente. Normalmente, esses utilizam métodos de sequenciamento de Sanger.

Embora tenham a vantagem de identificar múltiplos genes, o seu preço comercial alto e baixo rendimento limitam sua utilização. Ademais, à medida que novos genes associados a esses distúrbios são descobertos, os testes anteriores podem se tornar rapidamente obsoletos.

> Análise de microarray cromossômica (CMA)

É uma técnica baseada em array de hibridização genômica comparativa que detecta alterações estruturais clinicamente significativas, especificamente deleções ou duplicações no genoma, conhecidas como variação do número de cópias (CNV).

É considerada um teste de primeira linha para pacientes com deficiências de desenvolvimento e intelectuais inexplicáveis, transtorno do espectro autista ou anomalias congênitas, com base em seu rendimento diagnóstico.

O seu uso é complementar ao sequenciamento de exoma clínico (CES) para detectar variações estruturais que esse teste não consegue isoladamente. É fundamental ressaltar que a seleção cuidadosa do paciente por meio de uma avaliação clínica especializada e a validação da metodologia de teste são pré-requisitos invariáveis para garantir um diagnóstico genético preciso e a utilidade clínica.

> Sequenciamento de exoma clínico

O CES utiliza a metodologia de sequenciamento de próxima geração, que o torna um método rápido e com um custo significativamente reduzido em comparação com o método de Sanger. É capaz de detectar os mesmos tipos de mutações que o sequenciamento de Sanger (como mutações pontuais, pequenas inserções/deleções e mutações em locais de splicing), mas em todo o exoma.

Uma importante consideração é a profundidade de cobertura, que indica quantas vezes cada nucleotídeo é visualizado, aumentando a certeza na detecção de mutações e reduzindo o risco de falsos negativos. Além disso, como o teste não é limitado apenas a genes associados a um sintoma ou fenótipo particular, minimiza o efeito de erros de fenotipagem ou variabilidade.

Por fim, como o sequenciamento de DNA não muda com o tempo, os resultados do sequenciamento do exoma podem ser reinterpretados à medida que novos dados clínicos são relatados, aumentando as chances de um resultado positivo, mesmo que o teste inicial seja inconclusivo.

·       Uso adequado

O uso adequado do CES exige uma priorização clínica meticulosa, uma vez que não deve ser considerado um teste de primeira linha ou de rastreamento para qualquer suspeita de distúrbio genético. O primeiro passo é uma avaliação clínica completa. A decisão de prosseguir com o exame deve basear-se na disponibilidade de testes com validade analítica e clínica estabelecidas, e utilidade clínica comprovada para o fenótipo em questão.

Em situações de incerteza diagnóstica, onde o fenótipo por si só não é conclusivo, o CES pode abreviar ou interromper a cascata de testes diagnósticos caros e demorados, como neuroimagem, biópsias, análises químicas invasivas e análise de líquido cefalorraquidiano, ao estabelecer um diagnóstico genético raro e específico. Além disso, o CES melhora os cuidados preventivos ao alertar os médicos para comorbidades não antecipadas e oferece benefícios preventivos para os membros da família, aliviando preocupações sobre o risco de transmissão e identificando indivíduos que necessitam de cuidados ou vigilância mais especializados para reduzir futuras complicações da doença.

Embora testes genéticos de alto rendimento mais específicos, como o sequenciamento de gene único ou de múltiplos genes, possam ser indicados para pacientes com um distúrbio genético suspeito específico e um fenótipo classicamente descrito, o CES torna-se a estratégia de avaliação mais eficaz e custo-efetiva quando há uma suspeita de etiologia genética com um amplo diagnóstico diferencial. Esta abordagem é aplicável tanto a crianças quanto a adultos e pode fornecer achados clinicamente significativos mesmo em pacientes sem histórico familiar claro da doença, refletindo mutações de novo ou herança recessiva. A eficácia do teste não se limita a categorias específicas de doenças, mas é generalizada em diversos fenótipos resultantes de etiologias genéticas díspares, com taxas de diagnóstico que variam de aproximadamente 20% a 80% para vários fenótipos testados.

É fundamental que todos os pacientes considerados para o CES recebam aconselhamento genético adequado. Isso garante uma compreensão completa da natureza do teste, seus benefícios e limitações, e a interpretação clínica precisa dos resultados.

·       Desafio e limitações do CES

O CES enfrenta dois desafios principais: o primeiro é um debate conceitual sobre o valor de um teste que nem sempre leva a uma melhora imediata no resultado. O segundo está relacionado a questões técnicas, principalmente a completude da cobertura gênica, a validação dos resultados e a interpretação das variantes. Embora a tecnologia tenha avançado significativamente, ainda pode haver porções do exoma que não são sequenciadas de forma igual, ou seja, uma mutação pode existir em uma região com cobertura reduzida. No entanto, melhorias técnicas têm minimizado essa preocupação. A validação dos resultados, tradicionalmente realizada por sequenciamento de Sanger, muitas vezes não é mais considerada necessária para variantes de qualidade suficiente. A interpretação de variantes, no entanto, permanece um processo extenso e complexo devido ao grande volume de dados gerados. A metodologia de avaliação de variantes pode diferir entre os laboratórios, o que pode levar a interpretações distintas de variantes idênticas.

Além disso, existem considerações éticas significativas associadas ao CES. Uma delas são as variantes de significado incerto (VSI), que são alterações genéticas novas ou raras na população e não foram previamente associadas a doenças. Embora as VSIs não sejam exclusivas do CES, a sua ocorrência pode gerar resultados indeterminados, mas ainda clinicamente relevantes. Outra preocupação são os achados incidentais ou secundários, que são resultados inesperados, mas clinicamente significativos encontrados em aproximadamente 4% a 5% dos pacientes.

A área do CES está em rápida evolução, e o seu futuro aponta para avanços significativos. Atualmente, o teste está se estabelecendo como o padrão para um diagnóstico eficiente e custo-efetivo em casos neurogenéticos complicados. No entanto, espera-se que o campo da genética e genômica humana continue a mudar rapidamente, o que servirá como um prelúdio para progressos ainda maiores. Entre as futuras direções esperadas estão a melhoria dos métodos de análise bioinformática, o desenvolvimento de bases de dados mais extensas sobre a variação genética humana normal, e aprimoramentos nas metodologias e equipamentos de sequenciamento de próxima geração. Além disso, prevê-se uma utilização clínica mais generalizada do exame.