Propionato de imidazol: um novo biomarcador para aterosclerose?

A aterosclerose é uma doença multifatorial complexa, cuja prevenção se baseia em escores tradicionais de fatores de risco cardiovascular que não identificam indivíduos em risco de doença vascular aterosclerótica em estágios iniciais. As suas principais intervenções farmacológicas estão ligadas a fatores de risco estabelecidos (metabolismo lipídico e, recentemente, inflamação). Isso enfatiza a necessidade de exploração de tratamentos que visem outros fatores em sua fisiopatologia, particularmente para pacientes que, apesar do tratamento ideal, ainda apresentam risco cardiovascular residual significativo.

A comunicação cruzada entre os metabolismos da microbiota e do hospedeiro contribui para a doença cardiovascular (DVC). No entanto, apenas alguns metabólitos dependentes da microbiota intestinal que se correlacionam com os estágios tardios da doença foram descritos. Por isso, Mastrangelo e colaboradores (2025) realizaram um estudo com objetivo de identificar metabólitos microbianos associados aos estágios iniciais da doença vascular aterosclerótica que poderiam contribuir para a progressão da doença.

Para rastrear metabólitos microbianos que poderiam afetar a progressão da aterosclerose, os pesquisadores alimentaram camundongos que carecem de um gene que codifica a apoliproteína E (ApoE -/-) propensos à aterosclerose com diferentes dietas com ou sem tratamento com antibióticos para esgotar a microbiota. Dietas ricas em colesterol (HC) induziram a doença, que foi parcialmente prevenida após o tratamento com antibióticos com dieta HC suplementada com colina (HC/HC). A metabolômica não direcionada mostrou uma remodelação substancial do metaboloma plasmático associada à alteração da composição da microbiota intestinal após dieta e administração de antibióticos. Notavelmente, os autores identificaram o Propionato de imidazol (ImP), um metabólito dependente da microbiota, como altamente associado à aterosclerose após alimentação com HC. A sua concentração plasmática também foi associada a mudanças na ecologia microbiana intestinal após intervenção dietética, particularmente com um enriquecimento relativo de Escherichia e Shigella, ou Eubacterium.

Em seguida, os pesquisadores investigaram se o aumento da concentração plasmática de ImP também estava associado à aterosclerose em humanos. Para isso, o estudo analisou duas coortes independentes de voluntários assintomáticos, ou seja, pessoas que não apresentavam sintomas de doença cardiovascular.

A primeira foi a coorte Progression of Early Subclinical Atherosclerosis (PESA), composta por 400 voluntários, dos quais 295 foram classificados com aterosclerose subclínica e 105 como controles saudáveis. A classificação foi realizada por meio de técnicas avançadas de imagem multimodal e multiterritorial. Utilizando metabolômica direcionada, os pesquisadores mediram as concentrações plasmáticas de ImP e metabólitos relacionados, como a histidina e o ácido urocânico.

Os resultados mostraram que as concentrações de ImP no plasma eram seletivamente e significativamente mais elevadas nos indivíduos com aterosclerose subclínica em comparação com os controles saudáveis, enquanto os níveis de histidina e ácido urocânico não apresentaram diferenças. Foi observada uma associação linear entre as concentrações de ImP e a presença de aterosclerose, e uma não linear com a extensão da doença, definida pelo número de locais vasculares afetados e pelo escore de cálcio na artéria coronária (CAC).

Para validar essas descobertas, os pesquisadores analisaram uma segunda coorte independente, a coorte impaired glucose tolerance (IGT), que incluía 529 controles e 1.315 indivíduos com aterosclerose subclínica. Notavelmente, a associação entre níveis elevados de ImP e aterosclerose em estágio inicial foi confirmada nesta segunda população, reforçando a robustez dos achados.

O estudo também investigou a relação do ImP com fatores de risco cardiovasculares estabelecidos. Em ambas as coortes, níveis mais altos do metabólito correlacionaram-se diretamente com um perfil cardiometabólico adverso, incluindo glicose em jejum elevada, aumento da proteína C-reativa de alta sensibilidade (hs-CRP), maior índice de massa corporal (IMC), gordura visceral, dislipidemia, hipertensão e níveis mais baixos de colesterol HDL.

Uma análise revelou que, mesmo após ajustar para fatores de risco tradicionais como idade, sexo, tabagismo e colesterol LDL, os níveis mais elevados de ImP permaneceram independentemente associados aos principais desfechos de aterosclerose. Isso sugeriu que o metabólito pode atuar como um indicador de risco independente da aterosclerose. Além disso, o ImP demonstrou ter valor aditivo na discriminação da prevalência da aterosclerose quando combinado com biomarcadores já consolidados, como o colesterol LDL e a hs-CRP.

Uma análise mais aprofundada na coorte PESA classificou os indivíduos com aterosclerose subclínica em dois grupos: aqueles com aterosclerose metabolicamente ativa (FDG+) e aqueles com doença inativa (FDG-). Concentrações plasmáticas de ImP significativamente mais altas foram observadas no grupo com aterosclerose ativa. A estratificação adicional revelou que esses níveis eram mais elevados nos subgrupos com ativação da medula óssea e inflamação sistêmica. Mesmo após o ajuste para fatores de risco convencionais, a associação permaneceu significativa em todos os subgrupos de aterosclerose metabolicamente ativa.

Para estabelecer uma relação causal entre os níveis elevados de ImP e a aterosclerose, e não apenas uma associação, os pesquisadores realizaram experimentos de intervenção em modelos de camundongos propensos à doença, mas alimentados com uma dieta padrão (chow), que normalmente não induz aterosclerose. Em dois modelos genéticos distintos, Ldlr−/− (camundongos com gene que codifica a lipoproteína de baixa densidade desativados, levando à hipercolesterolemia) e Apoe−/−, os cientistas administraram ImP na água de beber por 8 a 12 semanas.

Notavelmente, a suplementação com ImP foi suficiente para induzir o desenvolvimento de aterosclerose em ambos os modelos. A análise das aortas e das raízes aórticas mostrou um aumento significativo no tamanho das lesões ateroscleróticas nos animais que receberam o metabólito em comparação com os seus controles. Essa descoberta crucial foi acompanhada por outra observação fundamental: o efeito pró-aterogênico do ImP ocorreu sem alterar as concentrações de colesterol ou glicose no sangue circulante. Isso indicou que o metabólito impulsionou a doença através de mecanismos independentes do metabolismo lipídico, que é o alvo primário das terapias cardiovasculares mais comuns.

Para compreender os mecanismos subjacentes, o estudo investigou as alterações no sistema imunitário. A administração de ImP foi associada a uma ativação robusta da imunidade inata e adaptativa. Camundongos Apoe−/− suplementados apresentaram uma expansão de populações de células imunes pró-inflamatórias e pró-aterogênicas no sangue, como monócitos Ly6Chi e células T auxiliares do tipo 1 (TH1) e 17 (TH17).

A análise aprofundada da aorta dos camundongos tratados com ImP, utilizando sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq), revelou um aumento no número relativo de fibroblastos, células endoteliais e, crucialmente, de células imunes infiltradas na parede do vaso.

A importância da resposta imune adaptativa foi destacada por um experimento em que camundongos Ldlr−/− foram transplantados com medula óssea de doadores Rag1−/−, que não possuem células T e B funcionais. Nesses, a capacidade do ImP de induzir aterosclerose foi marcadamente reduzida, confirmando que as células T e B são essenciais para os efeitos pró-aterogênicos do metabólito.

Além disso, o ImP induziu mudanças transcricionais nas células da aorta, como macrófagos, fibroblastos e células endoteliais, ativando vias associadas à inflamação e ao recrutamento de células imunes. Experimentos in vitro mostraram que o metabólito conseguia ativar diretamente macrófagos e fibroblastos, levando-os a produzir quimiocinas que recrutam mais monócitos para o local da inflamação.

Para entender detalhadamente como o ImP age nas células da parede aórtica, os pesquisadores realizaram uma análise do transcriptoma de célula única (scRNA-seq) em aortas de camundongos Apoe−/− alimentados com dieta normal, que receberam ImP por quatro semanas.

A análise de enriquecimento de conjuntos de genes (GSEA) revelou que a suplementação induziu um aumento significativo em vias transcricionais associadas à inflamação em três tipos celulares: macrófagos, fibroblastos e células endoteliais. Essas descobertas foram consistentes com análises de sequenciamento de RNA (RNA-seq) de células em cultura, que mostraram uma rápida indução de vias inflamatórias e de ativação, especialmente em macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) e em fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs), mas não em células endoteliais aórticas de camundongo (MAECs). Sendo assim, macrófagos e fibroblastos podem ser os principais alvos diretos do ImP na parede do vaso.

Para aprofundar a análise, os pesquisadores reclusterizaram cada tipo de célula, identificando subpopulações distintas: quatro subclusters de macrófagos, cinco de fibroblastos e três de células endoteliais. A análise do efeito do ImP nesses grupos mostrou mudanças significativas na composição celular:

• Em macrófagos, houve uma redução no subcluster MF1, associado a genes homeostáticos, e um aumento no subcluster MF3, que expressa os ligados ao metabolismo lipídico, inflamação e ativação de macrófagos.

• Em fibroblastos, o ImP induziu a expansão dos subconjuntos FB2, FB3 e FB4. Esses foram caracterizados pela expressão de genes associados, respectivamente, à resposta à acetilcolina, à resposta imune e inflamação, e à organização da matriz extracelular. Os efeitos foram corroborados por experimentos in vitro, nos quais o ImP ativou diretamente os MEFs, levando-os a produzir a proteína quimioatraente de monócitos-1 (MCP-1), que aumentou o recrutamento de monócitos, um processo chave na aterogênese.

• Em células endoteliais, o subconjunto EC1 foi enriquecido na aorta após o tratamento com ImP. Este expressava genes que regulam a função endotelial, marcadores mesenquimais e genes pró-angiogênicos.

Além das mudanças na expressão gênica, uma análise fosfoproteômica revelou que o tratamento com ImP aumentou a abundância global de fosfopeptídeos pertencentes à via de sinalização mTOR em macrófagos e fibroblastos in vitro. Essa ativação da via mTOR é um passo crucial, pois a deleção seletiva do gene Raptor (um regulador do mTOR) em células mieloides preveniu a aterosclerose. Além disso, o ImP aumentou a fosforilação da proteína ribossômica S6 (p-S6), um indicador da ativação do mTOR, tanto em células in vitro quanto em macrófagos in vivo.

Após estabelecer que o ImP causa aterosclerose através de uma resposta inflamatória dependente da via mTOR, os pesquisadores buscaram identificar o receptor celular específico através do qual ele exerce seus efeitos. A estrutura química do ImP, que contém um anel de imidazol, levou à hipótese de que ele poderia ser detectado pelos receptores de imidazolina I1R e I2R, que são expressos de forma ubíqua no corpo.

Para testar essa hipótese, foram realizados experimentos in vitro com macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) e fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs). As células foram tratadas com ImP na presença de diferentes antagonistas de receptores. O tratamento com AGN192403, um antagonista seletivo do I1R, bloqueou de forma eficaz a ativação da via mTOR (medida pela fosforilação da proteína p-S6) e a produção da citocina inflamatória TNF, ambas induzidas pelo ImP. Em contraste, outros antagonistas, como o idazoxan (que bloqueia receptores de imidazolina de forma mais ampla) e o yohimbine (um antagonista de adrenoreceptores α2), não tiveram o mesmo efeito inibitório seletivo. Uma análise fosfoproteômica confirmou que o AGN192403 inibiu a ativação da via mTOR induzida pelo ImP.

Para confirmar que o I1R era de fato o receptor do ImP, os pesquisadores utilizaram a técnica de silenciamento de genes com RNA de interferência (siRNA) para suprimir a expressão do gene Nisch (que codifica o receptor I1R) em MEFs. Esse silenciamento impediu a capacidade do ImP de induzir a fosforilação de p-S6 e a produção de TNF, demonstrando que o metabólito sinaliza seletivamente através do I1R para mediar essas funções inflamatórias.

A investigação então se voltou para o papel das células mieloides in vivo. Foram gerados camundongos geneticamente modificados (Lyz2ΔNisch) nos quais o gene Nisch (I1R) foi seletivamente deletado apenas em células mieloides. Os BMDMs derivados desses camundongos mostraram-se completamente resistentes à ativação induzida pelo ImP, confirmando que o I1R em é o seu receptor principal.

O experimento para estabelecer a causalidade in vivo envolveu o transplante de medula óssea. Camundongos Ldlr−/− foram irradiados e receberam transplantes de medula óssea de camundongos Lyz2ΔNisch (sem I1R mieloide) ou de controles (Nischfl/fl). Após a reconstituição da medula óssea, os camundongos foram tratados com ImP. A ausência do receptor I1R preveniu completamente a aterosclerose induzida pela administração do metabólito.

Após identificar o eixo ImP - I1R como um mecanismo causal no desenvolvimento da aterosclerose, os pesquisadores investigaram se o bloqueio farmacológico desse eixo poderia ser uma estratégia terapêutica eficaz. Para isso, utilizaram AGN192403, um antagonista específico do I1R, em dois modelos experimentais distintos de aterosclerose em camundongos.

Primeiramente, para avaliar se o bloqueio poderia prevenir a aterosclerose induzida pelo ImP, camundongos Apoe−/− alimentados com uma dieta normal foram tratados simultaneamente com ImP e AGN192403 na água de beber por oito semanas. Os resultados mostraram que o tratamento inibiu completamente a formação de placas ateroscleróticas induzidas pelo ImP, tanto em camundongos machos quanto fêmeas. Este efeito protetor ocorreu sem afetar os níveis plasmáticos de colesterol total ou as concentrações do próprio metabólito, reforçando que a intervenção agia sobre a via inflamatória e não sobre o metabolismo lipídico. A análise do sistema imunitário revelou que o AGN192403 reverteu os efeitos pró-inflamatórios do ImP: preveniu a expansão de monócitos Ly6Chi e células TH1 no sangue, bloqueou a produção de citocinas inflamatórias como TNF e IFNγ, e impediu o aumento da fosforilação da proteína S6 (p-S6) em macrófagos peritoneais, um marcador da ativação da via mTOR. Além disso, o tratamento reduziu a infiltração de células imunes na aorta, bloqueando o aumento da proporção de células TH1 em relação às células T reguladoras (Treg) e prevenindo a infiltração de macrófagos pró-inflamatórios e células B.

Em seguida, para testar a eficácia do bloqueio do I1R em um cenário terapêutico mais realista, tratando a doença já estabelecida e induzida por dieta, os pesquisadores alimentaram camundongos Apoe−/− com uma dieta rica em colesterol (HC) por oito semanas. Nas últimas quatro semanas, um grupo de camundongos continuou apenas com a dieta HC, enquanto outro grupo recebeu a esse padrão alimentar juntamente com o tratamento com AGN192403. Os resultados foram notáveis: a suplementação inibiu significativamente a progressão da aterosclerose em camundongos que já desenvolviam a doença devido à dieta rica em colesterol. Este efeito foi observado tanto em machos quanto em fêmeas, e novamente, ocorreu de forma independente dos níveis de colesterol no plasma, que permaneceram elevados em ambos os grupos.

A análise histológica das placas mostrou que o tratamento com AGN192403 não apenas reduziu o tamanho da placa aterosclerótica, mas também a sua complexidade. A nível sistêmico, o tratamento preveniu o aumento de monócitos Ly6Chi e a imunidade TH1 induzidos pela dieta HC, além de suprimir a ativação de macrófagos.

Em conclusão, Mastrangelo e colaboradores (2025) propuseram que o ImP seria um alvo diagnóstico para a aterosclerose subclínica ativa e o receptor I1R um alvo terapêutico inovador, com potencial para complementar as terapias atuais focadas em lipídios e para tratar o risco cardiovascular residual que afeta muitos pacientes.