Medicina regenerativa y una experiencia en fonoaudiología

En los últimos meses se han venido dando una serie de acontecimientos que más allá de desalentar, reviven las ganas de trabajar arduamente en todo aquello que no se conoce o que no se ha indagado a gran profundidad; así como la frase de Louis Pasteur: «Si no conozco una cosa, la investigaré»; y es precisamente con la motivación de dar nuevas respuestas, ampliar el conocimiento y obtener resultados tangibles, lo que lleva a este grupo de investigación compuesto por estudiosos de fonoaudiología a nunca quedarse con lo mismo, a seguir trabajando en la propuesta en el Laboratorio de Investigaciones en Salud (LIS) en Bogotá – Colombia; existe un compromiso de reinventarse y seguir generando aportes para la medicina regenerativa, la cual aún tiene un campo con muchos espacios sin llenar, que tanto estudiosos como profesionales tienen la disposición de apostar a nuevos conocimientos.

El primer paso para la reconstrucción de tejidos es la descelularización, la cual se define como el “proceso de utilizar varios métodos físicos, enzimáticos y químicos para lisar las células y remover los componentes celulares del tejido mientras se preservan los componentes extracelulares nativos” (Lopresti & Brown, 2015) citado por (Vega, 2019); la finalidad de la descelularización es eliminar los epítopos y antígenos celulares que provocan respuestas inmunitarias potencialmente destructivas que resultan en la falla del implante mientras se preserva la composición y la configuración de macromoléculas de la MEC. (Lopresti & Brown, 2015) citado por (Vega, 2019).

Otro aspecto importante para esta investigación es el cultivo celular, el cual hace referencia a la eliminación de células tanto de animales como de vegetales para luego cultivar en un entorno artificial; esta técnica hoy en día es una herramienta fundamental para el estudio de diferentes disciplinas, como la bioquímica, la biotecnología, la biomédica, como en numerosas aplicaciones industriales entre las que destacaremos la producción de biofármacos y la medicina regenerativa (Reina et al., 2020), factores de crecimiento, los cuales se encargan de estimular a las células madres y potenciar la regeneración de tejido y por último, la matriz extracelular (MEC), la cual funciona como soporte (andamio) de la proliferación de las células madre y generación de tejido (Isaza et al., 2018).

Centre of Polymer Systems, University Institute, Tomas Bata University in Zlín, Czech Republic.

Por otro lado, la medicina regenerativa es una especialidad que se basa en la regeneración de tejidos y órganos; el término “regeneración” se define como la facultad que tiene el organismo humano de tratarse y curarse así mismo; existen 3 elementos de la medicina regenerativa las cuales son:

1. Las células madres.
2. Los factores de crecimiento.
3. La Matriz Extracelular (MEC).

Como fonoaudiólogos amantes de la investigación buscamos introducir la Medicina Regenerativa como un nuevo campo en la fonoaudiología, puesto que estos profesionales tienen las competencias necesarias para incursionar en esta área; además, la finalidad de este proyecto de desarrollar biomateriales que sirvan como una forma de resolver la ausencia o daño de algún órgano y dar una opción para que estas personas tengan una mayor calidad de vida reconociendo que dentro de la diversidad todo es posible; como investigadores seguimos en la búsqueda de generar estas posibilidades que no solo sean viables para cualquier individuo sino también accesibles.

Para la realización de la investigación fue necesaria la consecución de la vejiga de cerdo, lo cual se realiza en el matadero del municipio de Guayabal de Síquima (Cundinamarca). Posteriormente, la vejiga de cerdo pasa por un proceso de congelación para evitar la descomposición e infección del órgano; estando congelada se traslada al laboratorio de investigaciones en salud (LIS); este proceso se realiza en una nevera a 4 grados centígrados con el fin de preservar el órgano.

Una vez en el laboratorio se realiza un lavado con solución salina al 5 % durante una hora. Para iniciar el proceso de descelularización dentro del laboratorio en donde se utilizan procesos químicos, físicos y enzimáticos; dentro de los procesos químicos, se usan detergentes que van a ir “lavando” el tejido; este proceso dura entre 3 y 5 días; luego se inicia el medio físico que consiste encender la cabina de flujo laminar tipo II y colocarlo en UV, congelación a -20 °C y congelación en nitrógeno líquido a -180 °C.

Entre los químicos utilizados están el hipoclorito al 5,25 %, el etanol al 99,9 %, el glutaraldehído al 2 %, amonio cuaternario en concentración al 0,25 %, formaldehido al 37 %, todo esto se hace con el fin de eliminar las bacterias, virus y hongos que pueda tener. Luego de esto se inicia con un proceso de congelación a -20 grados por 24 horas con el fin de eliminar las células residuales y se realiza un lavado con PBS en concentración al 1 X y agua desionizada con el fin de llevarla a la cabina de flujo laminar; esto con el fin de acabar de descelularizar para pasarla al termo de nitrógeno donde estará a -180 grados.

El proceso de descelularización se repite por 8 días con el fin de permitir que solo quede la matriz extracelular (MEC); esta toma un color amarillo claro y trasparente, se coloca en secado al medio ambiente estéril y por último se irradia de nuevo en la cabina de flujo laminar.

 Figura 1. Materia prima para el proceso de descelularización. 

Durante el proceso también se realizan pruebas genéticas, para detectar si queda algún residuo de gen de porcino dentro de la membrana de colágeno. Para esto, se envió una muestra al Centre of Polymer System University Institute Tomas Bata. University in Zlin Czech Republic (Instituto de la República Checa). Espectrografía infrarroja por transformada de Fourier. 

 Figura 2. Vejiga descelularizada

La descelularización conlleva entonces a distintos pasos para la obtención del andamiaje para el posterior cultivo de células in vitro; este proceso varía en función al órgano utilizado; para esto es necesaria la utilización de diferentes medios como lo son los químicos, físicos y enzimáticos.

Durante este estudio de investigación se comprobó la eficacia del proceso de descelularización por medio de caracterización cuantitativa y cualitativa; observando la coloración de la Matriz extracelular de cerdo (MEC) la cuál debe ser blanca, pues indica que el proceso de descelularización se está llevando a cabo correctamente. 

Figura 3. Membrana de MEC en prototipos depabellón auricular

Figura 4. Membrana en proceso de descelularización

 Teniendo un resultado positivo frente a esta investigación, se evidencia buena adhesión al tejido sin contaminación ni alteración del pH.

Figura 5. Recorte de la MEC

Se obtuvieron prototipos del diámetro 1,5 mm, grosor 0,004mm-0,09mm, con características de la superficie para la adherencia de las células al tejido, pues es necesario en la medida que para esta investigación se requiere como estructura de soporte para el cultivo de células ovinas anteriormente extraídas.

Durante el estudio fue fundamental monitorear el cambio de pH que tenía la MEC frente al medio de cultivo, pues esto indica cuán viable es el tejido para el cultivo de células; en el estudio se confirmó que es factible la MEC para el cultivo de estas.

Por último, se realizó un conteo de las células que fueron cultivadas en el prototipo de MEC, pues esto indica qué tan viable es el tejido.    
Figura 6. Cultivo de células en MEC 

En este estudio se realizó la descelularización de una vejiga de porcino, donde se comprueba la ausencia de dichas células, la adherencia y la respuesta de las células al tejido; aspectos relevantes al momento de la generación de tejidos (Granados, Montesinos & Pérez, 2017). El proceso y la técnica de descelularización que se llevó a cabo en el laboratorio de investigación en salud -LIS- resultó ser exitoso demostrando en varias pruebas que soluciones como el PBS y/o el medio de cultivo no cambian su coloración  ni su pH, lo que significa la ausencia de microorganismos que alteren dichos aspectos dentro de las soluciones anteriormente mencionadas; de este modo, la asepsia y antisepsia de los procedimientos resultan ser efectivos para la preparación de tejidos aptos para iniciar sobre los mismos un cultivo celular (Instituto nacional de cancerología ESE, 2019).

Los resultados sobre las muestras tomadas dentro del laboratorio de investigación en salud son un avance significativo en la reconstrucción de una membrana timpánica, puesto que se evidencia biocompatibilidad entre las células y el tejido previamente descelularizado; aparte del aspecto anteriormente mencionado es importante decir que se obtuvo una adherencia de las células como fibroblastos y la generación de fibrina, lo que indica los primeros pasos para la adaptación de las células y la generación de un tejido resistente, dichos resultados demuestran exitosamente la eficacia de la estructura para la implantación de las células y la proliferación de las mismas.

 
Figura 7. Adherencia de las células

Una de las limitaciones más significativa del estudio fue el número de cultivos celulares, debido a que fueron pocos; es por ello por lo que los investigadores fueron rigurosos en el proceso de limpieza y lavado del tejido con el propósito de asegurar el éxito de cada una de las muestras y de las pruebas realizadas en el laboratorio.

La presente investigación abre el paso a nuevas investigaciones sobre la adaptación del tejido en forma circular para la membrana timpánica con diferentes moldes hechos del mismo u otros materiales y de esa forma evaluar el comportamiento que tiene frente a la presencia de dichos moldes. 

Después de todo el arduo proceso que cautelosa y reiterativamente se desarrolló, se puede concluir que es necesario un adecuado proceso de descelularización de la MEC para proseguir con una efectiva recelularizacion, debido a que con ese primer paso es posible desarrollar un ambiente favorable para que las células de ovino crezcan; además, la MEC nuevamente resulta ser un medio viable para el cultivo de las células ya mencionadas porque estas se adhirieron con eficiencia demostrando el desarrollo de nuevo tejido que es finalmente el objetivo central de esta etapa de la investigación.

Una vez más, este compromiso con la ciencia investigativa a fin de dar soluciones con biomateriales, agregando posibilidades a los usuarios afectados por rupturas de membrana timpánica y las ganas de introducción en un nuevo campo como la medicina regenerativa en la fonoaudiología, comprueban que las capacidades del fonoaudiólogo son amplias para lograr múltiples acercamientos e integrar los conocimientos de la medicina regenerativa; además de aportar a la ciencia, este proyecto invita a seguir investigando sin desfallecer con entrega y dedicación por aquello que inspira el bien común.