Diabetes retarda a cicatrização da córnea

A investigação de Cedars-Sinai foi a primeira em descobrir mudanças na córnea relacionados com doenças e propôs abordagens terapêuticas potenciais para corrigir a cicatrização de feridas diabéticas.

Introdução

A diabetes está associada com modificações epigenéticas que incluem a metilação de DNA e mudanças no RNA mensageiro. As complicações diabéticas na córnea podem causar defeitos epiteliais persistentes e problemas de cicatrização de feridas devido a disfunção das células-mãe epiteliais (LESC). Por isso, Shah e colaboradores (2023) realizaram um estudo com o objetivo de descobrir alterações epigenéticas em células epiteliais límbicas humanas (LEC) diabéticas frente a não diabéticas enriquecidas em LESC e identificar novos marcadores diabéticos que podem ser o objetivo da terapia para normalizar a cicatrização de feridas epiteliais corneais e a expressão de células-mãe.

Métodos

Células epiteliais límbicas humanas (LECs) foram isoladas ou córneas cultivadas em órgãos obtidas de olhos de autópsia de doadores não diabéticos (59,87 ± 20,89 anos) e diabéticos (71,93 ± 9,29 anos). Os grupos não foram estatisticamente diferentes em idade. O DNA foi extraído do LEC para análise de metilação usando Illumina Infinium 850K MethylationEPIC BeadChip e a proteína foi extraída para análise de matriz de fósforo Wnt.

A cicatrização de feridas foi estudada usando um ensaio de raspagem em feridas de LEC ou 1-heptanol em córneas cultivadas em órgãos. Córneas cultivadas de órgãos e LECs foram transfectadas com siRNA WNT5A, mimetizador de miR-203a ou inibidor de miR-203a ou tratadas com Wnt-5a recombinante (200 ng/ml), inibidor de metilação de DNA zebularina (1–20 µmol/l) ou nanobioconjugados biodegradáveis (NBCs) com base na estrutura de ácido polimálico contendo oligonucleotídeo antisense (AON) para miR-203a ou um controle AON codificado (15–20 µmol/l).

Resultados

Houve metilação diferencial significativa do DNA entre LECs diabéticos e não diabéticos. O promotor WNT5A foi hipermetilado em LEC diabético acompanhado por uma proteína Wnt-5a marcadamente diminuída. O tratamento de células epiteliais límbicas humanas diabéticas (LECs) e córneas cultivadas em órgãos com Wnt-5a exógeno acelerou a cicatrização de feridas em 1,4 vezes (p<0,05) e 37% (p<0,05), respectivamente, e aumentou a expressão de LESC e do marcador diabético.

O tratamento com Wnt-5a em células epiteliais límbicas humanas diabéticas (LECs) aumentou a fosforilação de membros da via não canônica dependente de Ca²⁺ (fosfolipase Cγ1 e proteína quinase Cβ; em 1,15 vezes [p<0,05] e 1,36 vezes [p<0,05]], respectivamente). Em LECs diabéticos, o tratamento com zebularina aumentou os níveis de Wnt-5a em 1,37 vezes (p<0,01) e estimulou a cicatrização de feridas de maneira dependente da dose, com um aumento de 1,6 vezes (p<0,01) em 24 h.

Além disso, a zebularina também melhorou a cicatrização de feridas em 30% (p<0,01) em córneas cultivadas de órgãos diabéticos e aumentou a expressão de LESC e marcadores diabéticos. A transfecção destas células com siRNA WNT5A aboliu a estimulação da cicatrização de feridas pela zebularina, sugerindo que o seu efeito foi principalmente devido à inibição da hipermetilação do WNT5A.

O tratamento de células epiteliais límbicas humanas (LECs) da córnea e diabéticas cultivadas em órgãos com NBC melhorou a cicatrização de feridas em 1,4 vezes (p<0,01) e 23,3% (p<0,05), respectivamente, com maior expressão de LESC e marcadores diabéticos.

Investigadores de Cedars-Sinai proprocionaram uma nova compreensão de como a diabetes atrasa a cicatrização de feridos no olho, identificando pela primeira vez mudanças na córnea relacionados com a doença.

Os achados, publicados na revista revisada por pares Diabetologia, também identificaram três vias terapêuticas que reverteram estas mudanças e restauraram parcialmente a função de cicatrização de feridas na córnea, um descobrimento que em última instância poderia informar novos tratamentos para a diabetes.

“Descobrimos que a diabetes induz mais mudanças celulares do que sabíamos anteriormente”, disse Alexander Ljubimov, PhD, diretor do Programa de Olhos do Instituto de Medicina Regenerativa do Conselho de Governadores Cedars-Sinai e principal autor do artigo. “A descoberta não afeta a sequência genética, mas envolve modificações específicas no DNA que alteram a expressão genética, conhecidas como alterações epigenéticas.”

Mais de 37 milhões de pessoas nos Estados Unidos, 11% da população, tem diabetes, um transtorno sistêmico que pode provocar doenças renais, doenças cardíacas, amputações, derrames cerebrais e danos nos nervos. A maioria dos medicamentos para a diabetes estão desenhados para aumentar a tolerância a glicose ou subministrar a insulina, mas não abordam as mudanças moleculares e celulares e nem as suas complicações associadas.

O estudo também identificou pela primeira vez um papel importante de Wnt-5a, uma proteína de sinalização secretada que os investigadores encontraram responsável da cicatrização de feridas na córnea e a função das células mãe, células capazes de diferenciar-se em muitos tipos de células.

“Os tratamentos atuais somente abordaram os sintomas, portanto existe uma necessidade urgente de compreender os mecanismos moleculares dos problemas de cicatrização de feridas relacionados com a diabetes”, disse Ruchi Shah, PhD, cientista do laboratório de Ljubimov e primeiro autor do estudo. “Compreender este novo mecanismo de cicatrização de feridas regulado epigeneticamente pode levar a tratamentos terapêuticos que podem ajudar os pacientes a evitarem mais problemas de saúde ocular a longo prazo”.

Embora grande parte da atenção da doença diabética do olho esteja na retina, até 70% dos pacientes com diabetes sofrem de problemas da córnea.

Na diabetes avançada, as células mãe da córnea se tornaram disfuncionais e a córnea cicatriza mais lentamente e de forma menos completa depois de uma lesão ou de procedimentos como a cirurgia de cataratas e o tratamento com laser para retinopatia diabética.

Para identificar as mudanças epigenéticas descobertas neste estudo, mudanças que não estavam integradas no genoma desde o nascimento, mas que introduziram mais tarde, Ljubimov e seus colaboradores (2022) compararam células das córneas de seis pacientes diabéticos com as de cinco doadores saudáveis. Descobriram nas córneas diabéticas, o produto proteico do gene WNT5A estava reprimido. Além disso, em amostras de diabéticos encontraram um aumento no microRNA que inibe a WNT5A.

Logo, os pesquisadores induziram feridas nas células da córnea em cultivo e cultivos de órgãos corneais, e provou três intervenções desenhadas para normalizar a expressão da proteína WNT-5ª. Agregaram a proteína diretamente, introduziram um inibidor da metilação de DNA, originalmente aprovado para tratar o câncer; e se dirigiram aos níveis de microRNA com uma nova abordagem de terapia gênica utilizando um composto a nanoescala. A equipe desenvolveu o comporto, que utiliza moléculas sintéticas para bloquear o microRNA, como substituto de uma terapia gênica viram que encontraram tóxica para as células-mãe.

Os três métodos terapêuticos, nas amostras diabéticas, estimularam a produção de marcadores de células mãe e melhoraram a regeneração de tecidos, acelerando a cicatrização de feridas.

“Novas terapias para reverter os efeitos epigenéticos podem melhorar a função da córnea e também podem ser significativas noutras complicações diabéticas”, disse Clive Svendsen, PhD, diretor do Conselho de Governadores do Instituto de Medicina Regenerativa e coautor do estudo. “Este trabalho certamente ajuda a avançar no campo.”

Os investigadores continuaram analisando seus dados para compreender melhor os mecanismos de WNT5A e outros genes relacionados com a cicatrização de feridas. Também estão estudando uma terapia combinada para apontar tanto a metilação do microRNA como o DNA com a esperança de que normalize mais completamente a cicatrização de feridas ao aumentar a proteína WNT-5A.

“Nosso objetivo é desenvolver medicamentos tópicos de liberação sustentada para a cicatrização de feridas na córnea”, disse Ljubimov. “Os medicamentos aprovados pela FDA [Food and Drug Administration] e que possam ser facilmente aplicados podem ser uma das abordagens mais promissoras para futuras terapias eficazes.”