Anales de la Fundación Alberto J. Roemmers | 09 SEP 20

Inducción y caracterización de fenotipo colesterogénico mediante la tecnología de CRISPRon.

Tanto el colesterol como elevados niveles de uno de sus receptores (LDLR) se consideran factores de riesgo, promotores del crecimiento tumoral
Autor/a: Maria Paula Marks, Luciano Vellón, Juan Carlos Calvo, Sabrina Fletcher, Virginia Novaro, Jimena Rodriguez. 
INDICE:  1. Texto principal Parte (I) | 2. Texto principal Parte (II) | 3. Referencias bibliográficas
Texto principal Parte (I)

Resumen

La síntesis de novo de colesterol y su enzima limitante, hidroximetilglutaril-coenzima A reductasa (HMGCR), es crítica para la regulación de la proliferación y la supervivencia celular en cáncer.

El objetivo general del presente trabajo es estudiar el papel de la vía del colesterol en la adquisición de propiedades de células madre en modelos de cáncer de mama (CM). Con ese propósito, se desarrolló un modelo de sobreexpresión de HMGCR en la línea celular MCF-7 utilizando un sistema CRISPR activador (CRISPRon).

La generación de dicho sistema comprendió las siguientes etapas:

1. Diseño y síntesis de las sondas (sgRNAs)

2. Clonación de las sondas

3. Transformación de bacterias con los plásmidos clonados

4. Verificación de dichas construcciones por secuenciación

5. Transfección de líneas celulares

6. Caracterización del sistema.

La expresión de HMGCR aumentó significativamente en las células MCF-7/CR en comparación al control de transfección (MCF-7/TC), tanto a nivel transcripcional como proteico, y se observan niveles similares a los detectados en otros modelos de células madre (normales y tumorales).

El fenotipo HMGCRon se asoció a un incremento de los niveles de los marcadores de pluripotencia Nanog y Sox2, un  aumento en la población CD44+/CD24- y CD133+ y un aumento en la frecuencia de formación de mamoesferas, características asociadas a células madre tumorales (CMTs) en CM. A continuación, se evaluó la viabilidad de estas células en respuesta al tratamiento con simvastatina (SIM) y lovastatina (Lova).

Se encontró que las células MCF-7/CR muestran mayor sensibilidad a SIM que la línea control MCF-7/TC. Estos datos sugieren que la expresión de HMGCR está asociada a características de CMTs y determina, al menos en parte, la sensibilidad a estatinas, sentando las bases para estudios posteriores orientados a una terapéutica anti-colesterol específica para el compartimiento de células madre en CM.

 

Introducción

> Células Madre Tumorales

Según el modelo de Células Madre Tumorales (CMTs), el crecimiento del tumor, al igual que el desarrollo normal de cualquier tejido, depende exclusivamente de pocas células que componen el compartimiento de células madre. Por lo tanto, la mayoría de las células del tumor no poseen la capacidad de autorrenovación y por consiguiente no contribuyen a la perpetuación del mismo. En este modelo, la heterogeneidad tumoral surge exclusivamente de la diferenciación aberrante de las CMTs(1)(2).

Se considera que las CMTs tienen las mismas propiedades que las células madre normales: autorrenovación, resistencia a químicos, pueden permanecer en quiescencia por períodos largos de tiempo y son capaces de colonizar otras partes del cuerpo(3). Por lo tanto, este modelo parece explicar la resistencia a las terapias convencionales, recurrencia del tumor e incluso la metástasis(4). Sin embargo, este concepto “clásico o estático” conlleva la presunción de que la población de CMTs se mantiene estable e invariable a lo largo del tiempo y que el “estado de CMT” no puede ser adquirido por una célula tumoral diferenciada. Por el contrario, estudios recientes sugieren que el fenotipo de las CMTs es fluido y puede  ser regulado(4).

En  el desarrollo  normal, la plasticidad fenotípica de las células se encuentra altamente regulada. Por otro lado, las células tumorales diferenciadas son capaces de reactivar esta propiedad y adquirir un fenotipo de CMT. Las CMTs pueden cambiar de un estado CMT a uno no-CMT de manera reversible, dependiente de estímulos endógenos y exógenos, como por ejemplo cambios en el metabolismo celular(5). A este modelo se lo conoce como “Modelo dinámico de CMTs”.

Al-Hajj y colaboradores demostraron por primera vez la existencia de las CMTs en CM, al identificar que tan sólo 100 células CD44+/CD24-/low eran capaces de formar tumores en ratones inmunosuprimidos, mientras que células con otros fenotipos eran incapaces de hacerlo. Los tumores generados en los ratones presentaban las mismas características del tumor del paciente del cual las células fueron aisladas, y además, podían ser pasados serialmente, demostrando su capacidad de autorrenovación(6).

A pesar de la falta de consenso en cuanto al fenotipo y frecuencia de las CMTs en la mayoría de los tumores sólidos, en  los años siguientes a esta publicación, la evidencia apoyando la existencia de CMTs en este tipo de tumores fue ampliándose para incluir cerebro, colon, cuello y cabeza, páncreas, pulmón, melanoma y tumores mesenquimales y hepáticos(7)(8).

Las CMTs en mama pueden ser identificadas y aisladas por diferentes metodologías, incluyendo citometría de flujo para marcadores de superficie específicos, como CD44, CD24 y CD133, formación de mamoesferas en suspensión y actividad de la enzima aldehído deshidrogenasa (ensayo ALDEFLUOR)(9)(10)(11).

Además, algunos estudios han implicado a la transición epitelio-mesenquimal (EMT, Epithelial- Mesenchymal Transition) y a la transición mesenquimal-epitelial (MET, Mesenchymal- Epithelial Transition) en la generación de estados de CMTs. Estos trabajos identifican una subpoblación dentro del grupo de las CMTs que presenta características del tipo mesenquimal, potencial invasivo y se caracteriza por la expresión de los marcadores CD44+/ CD24-.

Por otro lado, existe una subpoblación proliferativa de CMTs con marcación positiva para ALDH y que se asemejan a un tipo más epitelial. Cabe destacar que, debido a la plasticidad fenotípica, estas células son capaces de hacer la transición entre estos estados de CMTs, en línea con el modelo dinámico(12).

Por otro lado, algunos de los factores utilizados en la generación de células madre con pluripotencia inducida (iPSCs) mediante la reprogramación celular, se han encontrado sobreexpresados en tumores agresivos y pobremente diferenciados, sugiriendo que algún tipo de desdiferenciación ocurre durante la formación del tumor (13) (14). Dos de estos factores (Myc y Klf4) son conocidos oncogenes, lo que resalta aún más el paralelismo entre estos dos procesos(15)(16).

Otros ensayos han sugerido que Sox2 está involucrado en la invasión y metástasis en muestras de neoplasia intraepitelial pancreática y en la carcinogénesis gástrica y de próstata. La expresión de Sox2 se ha observado en un alto número de carcinomas del tipo basal-like, vinculándolo a un fenotipo menos diferenciado y por otro lado, se ha propuesto que la reactivación de Sox2 representa un estadio temprano en la iniciación tumoral(17).

Oct4 se ha propuesto como marcador de tumores de líneas germinales y su expresión en células somáticas adultas resulta en falta de diferenciación, generando crecimiento displásico en tejidos epiteliales(18). La expresión de Nanog se ha asociado a peor pronóstico en carcinoma oral escamoso, y su expresión junto con Oct4 también lo es en carcinoma nasofaríngeo(19).

> Vía del mevalonato y HMGCR en cáncer

La reactivación de la síntesis de novo de lípidos, y en particular de colesterol, en tumores es un proceso que ha ganado importancia en los últimos años(20). La vía del mevalonato (MVA) es una vía anabólica esencial en las células, que utiliza acetil-CoA para producir esteroles e isoprenoides(21). Uno de los productos finales de esta vía es el colesterol, componente fundamental de las membranas celulares en vertebrados. Además, el colesterol es el precursor de múltiples biomoléculas de importancia biológica, como el ácido bílico, las hormonas esteroideas y los oxiesteroles(22)

Por otro lado, el colesterol es fundamental para la biogénesis de las balsas lipídicas (lipid rafts), ensamblados de lípidos y proteínas presentes en las membranas celulares, que están involucrados en el tráfico celular, transducción de señales y polarización celular. Esta vía también sintetiza dolicol y ubiquinona, moléculas involucradas en la glicosilación de proteínas, en el transporte de electrones en la mitocondria, y que cumplen funciones antioxidantes(23). Por otro lado, algunos isoprenoides sintetizados en esta vía son esenciales para la isoprenilación de proteínas, una modificación postraduccional fundamental para cientos de proteínas de señalización que sirve para anclarlas en las membranas celulares, permitiendo su correcta localización y función(22)(23).

Datos clínicos y experimentales sugieren que la hipercolesterolemia podría ser un factor de riesgo importante en algunos tipos de cánceres, como próstata y CM(24). Por otro lado, cambios en el metabolismo del colesterol se han relacionado con el desarrollo del cáncer(25)(26). Particularmente, se ha reportado que enzimas como HMGCR, FDPS, GGPPS, FDFT1 y SQLE están sobreexpresadas en diversos tipos tumores, incluyendo melanoma, glioblastoma, pulmón, colorrectal, próstata, ovario y CM. 
En general, se ha relacionado a la sobreactivación de esta vía metabólica con menor sobrevida libre de enfermedad, peor pronóstico o recurrencia más temprana(23)

Considerando el riesgo de desarrollo de cáncer o recurrencia en pacientes con obesidad o síndrome metabólico, se ha establecido una conexión entre la alteración del metabolismo lipídico y la tumorigénesis. Particularmente, los cambios en  el metabolismo  del colesterol observados en células tumorales incluyen no sólo la desregulación de la síntesis, sino que también alteraciones en la captación y/o eliminación.

Tanto el colesterol como elevados niveles de uno de sus receptores (LDLR) se consideran factores de riesgo, promotores del crecimiento tumoral y se asocian a peor pronóstico en cáncer de próstata, cerebro, colorrectal y CM (23). Es más, uno de los derivados del colesterol, el 27-hidroxicolesterol (27-HC), funciona como un modulador selectivo del receptor de estrógeno (ER) en tumores de CM ER+, al estimular el crecimiento tumoral y metástasis pulmonar en modelos preclínicos(27).

> Estatinas y cáncer

La disminución de la biosíntesis derivada de la vía del MVA podría resultar un interesante blanco terapéutico contra el cáncer. La inhibición de la enzima limitante de esta vía, HMGCR, se puede producir con unas drogas denominadas estatinas(28).

Los efectos antitumorales de las estatinas incluyen activación de la apoptosis y arresto del ciclo celular, inhibición de la proliferación, invasión y formación de colonias, supresión del crecimiento tumoral, angiogénesis y metástasis en diversos tipos de tumores como  glioblastoma, melanona, carcinoma de células escamosas, cáncer de próstata, gástrico, pancreático, colorrectal, de ovario y CM. Los efectos citotóxicos se detectan principalmente en células tumorales, mientras que las estatinas tienen escasa o nula toxicidad en células normales(23).

Evidencia preclínica, clínica y epidemiológica ha reportado que las estatinas impiden la proliferación, aumentan la apoptosis y reducen el riesgo de recurrencia en CM(28). Estudios en CM han reportado una disminución significativa en el riesgo de recurrencia mediado por estatinas lipofílicas, más no así en estatinas hidrofílicas(29). La prescripción de estatinas antes y después del diagnóstico está asociada a disminución de la recurrencia en CM y a mayor sobrevida.

La administración de dosis altas de atorvastatina y fluvastatina, previamente a la cirugía en pacientes con CM invasivo en estadios tempranos, indujo una disminución de la proliferación y aumento de apoptosis en los tumores.

Un meta-análisis de 41 estudios que incluyeron en total más de un millón de participantes, demostró que el uso de estatinas pre y post-diagnóstico está asociado a mejor sobrevida total y sobrevida libre de enfermedad(30). Por lo tanto, los efectos clínicos individuales de las estatinas pueden depender de sus propiedades químicas, del tiempo de administración, del tipo o estadio del tumor o de otras características del paciente como edad, comorbilidad y niveles de lípidos, entre otros(23).

> Fenotipo colesterogénico y células madre tumorales

A pesar de la vasta información disponible de la vía del MVA en el desarrollo del cáncer y de las estatinas como posibles agentes preventivos y/o terapéuticos, poco se conoce acerca de su influencia específica en la población de las CMTs.

En este contexto, algunos estudios han aportado evidencia sobre el rol esencial de la vía del MVA en la regulación de la población de CMTs. Por un lado, Sharon y colaboradores demostraron que la vía del MVA se encontraba sobreactivada en CMTs de colon, al comparar cambios en los perfiles de expresión de las células crecidas en monocapa con respecto a tumoroesferas(31).

Con un enfoque similar, Ginestier y colaboradores demostraron la sobreexpresión de genes de la vía del MVA en mamoesferas derivadas de líneas celulares triple negativas en CM. Más aún, luego de un tratamiento con simvastatina, estas líneas presentaron menor proporción de CMTs, y la adición de mevalonato era capaz de restituir esta población celular(32). Fiorillo y colaboradores encontraron sobrexpresión en  genes  de la vía del MVA al crecer como  tumoroesferas  líneas celulares luminales de CM y que derivados naturales de una fruta (bergamota) eran capaces de eliminar la población de CMTs, al inhibir a HMGCR de una manera similar a como lo hacen las estatinas(33).

También se ha demostrado que el tratamiento con lovastatina inhibe propiedades de CMTs en carcinoma nasofaringeo al inducir apoptosis y arresto del ciclo celular. Además, el tratamiento con lovastatina aumentó la sensibilidad de las CMTs hacia la quimioterapia(34). En CM, se aisló la población de CMTs en una línea luminal y se encontró una mayor apoptosis que en la línea parental luego de un tratamiento con simvastatina (35), y por otro lado se comprobó que el tratamiento con lovastatina dismminuyó la población de CMTs en líneas triple negativas. La reversión de estos efectos con la adición de mevalonato sugieren que los efectos anti-CMT de la lovastatina podrían atribuirse, al menos en parte, a la inhibición de HMGCR(36).

Por otro lado, se encontró que líneas celulares de CM resistentes a drogas estaban enriquecidas en CMTs, generando en consecuencia tumores más agresivos, y que el tratamiento con simvastatina era capaz de eliminarlas específicamente(37). Uno de los tratamientos estándares en osteosarcoma es el uso de adriamicina.

Estudios recientes han reportado que esta droga induce propiedades de CMT y promueve el potencial   metastásico en células de osteosarcoma al activar el oncogen KLF4. Interesantemente, el tratamiento con estatinas induce la pérdida de las propiedades de CMTs vía inhibición de KLF4(38).

Rennó y colaboradores demostraron los efectos inhibitorios de simvastatina sobre las CMTs en un modelo in vivo de carcinogénesis mamaria. Especificamente, encontraron que el tratamiento con esta droga, una vez que el tumor ya se ha establecido, inhibe el crecimiento tumoral, modula la heterogeneidad morfológica y disminuye la expresión de características asociadas a CMTs en mama(39).

En resumen, estos resultados indican, por un lado, que la vía del MVA está involucrada en la generación y mantenimiento de estados de CMTs en distintos tumores y por otro, que las estatinas podrían utilizarse para la eliminación selectiva de esta subpoblación. Por lo tanto, estas drogas podrían utilizarse como adyuvantes en terapias convencionales.

> Relevancia del proyecto

Las CMTs se definen por su habilidad para autorrenovarse y recapitular la heterogeneidad completa del tumor en cultivo y en xenoinjertos. Son altamente tumorigénicas y se las implica directamente en la resistencia a quimioterapia y radioterapia, lo que les confiere una gran importancia como dianas terapéuticas potenciales en cáncer, y en particular en CM.

Dada la baja frecuencia e inestabilidad in vivo de las CMTs, hay un  interés creciente en la generación  de modelos de CMTs in vitro, ya que podrían utilizarse para recrear el proceso de transformación oncogénica y los estadios tempranos del desarrollo tumoral. Esto proveería herramientas de valor para estudiar los mecanismos regulatorios involucrados en  la obtención  y mantenimiento  de estados CMTs y proveer plataformas para el desarrollo de drogas específicas(19). En este contexto, en el presente trabajo se propone el uso de distintas estrategias para modelar in vitro estados de CMT en CM con el fin de dilucidar el rol de la enzima HMGCR durante este proceso.
 

Materiales y Métodos

> Sistema CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 es un sistema inmune adaptativo presente en bacterias y Archaeas que las protegen de infecciones virales(40). El término CRISPR hace referencia a loci presentes en los genomas de estos microorganismos, que contienen secuencias con repeticiones palindrómicas  cortas, separadas por un “DNA espaciador” proveniente de exposiciones previas a un virus.

Los genes Cas (CRISPR-associated system) codifican para las nucleasas encargadas de cortar los elementos génicos exógenos, reconocidos por las secuencias espaciadoras(40)(41).

Este sistema ha sido adaptado para su uso en el laboratorio como método de edición génica. En este proyecto se utilizó una modificación del sistema original conocido como “CRISPRon”, que consiste en un sistema activador de la transcripción con dos componentes.

Uno de ellos es una proteína Cas9 fusionada a un dominio activador (VP160), cuya unión a la secuencia blanco se basa en la complementariedad de bases. Esta proteína presenta mutaciones que la inhabilitan para cortar el DNA pero que aún es capaz de dirigirse hacia la zona blanco, guiada por el segundo componente del sistema, los RNA guías. En el sistema CRISPRon, los RNA guías son diseñados para dirigir a la Cas9 al promotor del gen de interés(42)(43).

> Plásmidos

Se utilizó un sistema CRISPR-Cas9 para  activar  el gen  HMGCR humano. Este sistema está compuesto por un plásmido guía (pSPgRNA, Addgene # 47108), en el cual se clonó la secuencia de interés y un plásmido efector que codifica para la nucleasa Cas9 inactivada, junto con un dominio activador (pAC94-pmax-dCas9-VP160-2A-puro, Addgene # 48226). Ambos plásmidos fueron cedidos por el Dr. Federico Pereyra Bonnet del Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental del Hospital Italiano (ICBME).

> Transformación de bacterias, purificación y verificación del DNA plasmídico

Se transformaron bacterias competentes de la cepa DH5α de Escherichia coli con los plásmidos utilizados en este trabajo. En todos los casos, se realizó la transformación mediante shock térmico. Para ello, se incubó 1 µg del plásmido en 100 µL de bacterias competentes de la cepa mencionada por 30 minutos en hielo, seguido de 90 segundos a 42°C y 5 minutos en hielo nuevamente. Después, se agregaron 800 µL de medio Luria Bertani (LB) sin antibiótico y se incubó por 45 minutos a 37°C.

Luego de una centrifugación de 5 minutos a 1.000 rpm para concentrar  las bacterias, las mismas fueron sembradas en placas de Petri con LB y el antibiótico correspondiente (kanamicina 30 µg/mL para el plásmido activador y ampicilina 100 µg/mL para el plásmido guía). Las placas fueron incubadas overnight (ON) en estufa a 37°C. Al día siguiente, se seleccionó una colonia y se la sembró en 3 mL LB líquido con antibiótico y se incubó nuevamente ON a 37°C.

Este cultivo líquido se utilizó para obtener un stock de glicerol y para inocular un volumen mayor de medio (30 mL) con antibiótico que permitió amplificar el cultivo de bacterias transformadas. Se realizó una “midiprep” utilizando un kit de Quiagen (Quiagen Plasmid Midi Kit, cat #12143, Thremo) para lisar las bacterias transformadas y purificar el DNA de los plásmidos siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, se verificaron los plásmidos por digestión enzimática.

> Generación del Plásmido Guía del sistema CRISPR

Diseño y síntesis de sondas: Se utilizó una herramienta online gratuita disponible en la página http://crispr.mit.edu para seleccionar cinco sondas con homología a la región proximal del promotor del gen HMGCR humano. Las sondas fueron sintetizadas por Genbiotech.

Clonación de sondas: Se utilizó el protocolo de clonación de sondas del laboratorio del Dr. Zhang, disponible en la página http://www.genomeengineering.org/crispr/. Brevemente, se fosforilaron e hibridizaron cada par de sondas utilizando la enzima T4 PNK (cat # M0201S, NEB) a 37°C por 30 min y luego a 95°C por 5 min, seguido de una disminución progresiva de 5°C cada 5 min hasta llegar a los 25°C.

Por otro lado, por cada clonado a realizar, se digirió 1 ug de plásmido guía con la enzima BbsI (cat# ER1011, Thermo) a 37°C ON, la cual posee dos sitios de corte en la secuencia de interés (Figura 1). Luego, se agregó 1 µL de FastAP (cat # EF0654, Thermo) y se incubó 15 min a 37°C, seguida de una inactivación de 5 min a 75°C. Posteriormente, se sembraron las muestras en un gel de agarosa al 1% (P/V) con bromuro de etidio y se realizó una corrida electroforética con buffer TAE (Tris- Acetato 40 mM pH = 8; EDTA 1 mM) a 80 V durante 90 minutos. Se purificaron las bandas del gel utilizando un kit comercial (Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit, cat # 209034-70, GE Healthcare), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Finalmente, se realizó la ligación del plásmido guía digerido con los dúplex de oligonucleótidos fosforilados e hibridados utilizando la enzima T4 Ligasa (cat # EL0014, Thermo) durante 10 min a temperatura ambiente, seguido de una incubación de 1 hora a 4°C.

Transformación  de bacterias  y purificación  de los plásmidos: Se transformaron bacterias competentes de la cepa DH5α con el plásmido guía clonado con cada par de sondas mediante la técnica de shock térmico y se extrajo el DNA plasmídico como se describió previamente.

Verificación por secuenciación: Se seleccionaron dos colonias de bacterias transformadas con cada par de sondas clonadas, para secuenciar utilizando los servicios de Macrogen. Con los programas informáticos FinchTV y MEGA se determinó la presencia y la orientación del inserto en los clones evaluados.

Figura 1: Fragmento de la secuencia del plásmido guía donde se realiza la digestión enzimática con BbsI. Los sitios de corte se resaltan con triángulos rojos. Tomado de Genome Engineering Toolbox, Zhang Lab.

> Cultivo celular

Se utilizó la línea celular derivada de CM MCF-7, la línea comercial de células madre embrionarias WA-09, obtenidas del WiCell (Wisconsin, USA) por el LIAN del Instituto Fleni, y la línea de células madre con pluripotencia inducida (Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs) FN2.1, esta última, generada y caracterizada en dicho laboratorio(44).

El panel de CMTs derivadas de gliomas humanos utilizado en este trabajo fue obtenido y caracterizado por el Dr. Videla- Richardson en el Instituto Fleni(45). Se utilizaron frascos de cultivo (T25 y T75), placas de cultivo de Petri (p35, p60 y p100) y placas multipocillo (p96, p24, p12 y p6) de las marcas Corning (Corning, NY, EEUU.) y JetBiofil (Guangdong, China). Todas las líneas se mantuvieron en estufa de cultivo a 37°C en atmósfera de CO2  5%. Los medios de cultivo y suplementos utilizados para cada línea celular se detallan en la Tabla 1.

Tabla 1: Composición de los medios de cultivo utilizados para cada línea celular (SFB, Suero Fetal Bovino).


>
Transfección de líneas celulares con el sistema CRISPR.

Se partió de 350.000 células sembradas en placas de 6 pocillos (p6). Aproximadamente, al llegar a 80% de confluencia, se transfectaron las células con los plásmidos del sistema CRISPR. Se utilizó el reactivo de transfección FuGENE (cat #E2311, Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se utilizó la relación recomendada 3:1 de reactivo de transfección con respecto a la cantidad de plásmido.

Para los controles de transfección se utilizó 50% de plásmido activador y 50% de plásmido guía vacío, es decir, sin las secuencias que codifican para las diferentes sondas. Para las células con inducción de la expresión de HMGCR se utilizó 50% de plásmido activador y 50% de plásmido guía clonado (10% correspondiente a cada par de sondas).

Se colocaron los plásmidos y el FuGENE en tubos, los cuales fueron mezclados utilizando vórtex por 10 segundos e incubados a temperatura ambiente (T°amb) por 15 minutos. Luego, se colocaron 150 µL de esta mezcla en pocillos de p6, que ya tenían 3 mL de medio fresco. Las placas se incubaron en estufa hasta el momento de procesar las muestras.

 

Comentarios

Para ver los comentarios de sus colegas o para expresar su opinión debe ingresar con su cuenta de IntraMed.

AAIP RNBD
Términos y condiciones de uso | Todos los derechos reservados | Copyright 1997-2021