Investigación y ciencia | 09 SEP 20

Anales de la Fundación Alberto J. Roemmers

Resúmenes de trabajos destacados
Autor/a: María Catalina Olguin; Marta Delia Posadas; Gilda Celina Revelant; María Rosa Venezia. 
Impacto de la infección del virus Junín en la célula macrofágica.
Introducción general

Fiebre Hemorrágica Argentina

> Aspectos históricos

La Fiebre Hemorrágica Argentina (FHA), también conocida como el mal de los rastrojos, es una enfermedad endemo-epidémica de tipo zoonótica y origen viral que afecta principalmente a trabajadores rurales en la República Argentina. Esta enfermedad fue reconocida en 1955, mientras que el agente etiológico fue identificado y designado virus Junín (JUNV) por la región en la cual se aisló en 1958 [revisado en (Gomez et al., 2011)] .

> Epidemiología y transmisión

Desde su aparición, la zona endémica se ha extendido en forma ininterrumpida y actualmente incluye parte de las provincias de Buenos Aires, Entre Ríos, La Pampa, Santa Fe y Córdoba, estimándose que la población en riesgo de infección es de más de 5 millones de personas (Gomez et al., 2011). El vector natural y reservorio del virus es el roedor Calomys musculinus, aunque también se ha encontrado en otros roedores Calomys, cuya distribución y comportamiento explica la zona endémica de esta patología (Charrel and de Lamballerie, 2010). El roedor infectado suele no presentar síntomas, siendo una infección persistente. La transmisión a seres humanos se da principalmente a partir de los fluidos del animal infectado, tales como la orina, saliva y sangre. La infección ocurre en el contacto con material contaminado, por medio de escoriaciones de la piel o por las mucosas oral o conjuntival, o bien la inhalación de aerosoles [revisado en (Gomez et al., 2011)].

Historia natural

El periodo de incubación del JUNV varía entre 6 y 12 días, al final del cual se manifiestan los síntomas iniciales de la FHA. Durante la primer semana, los síntomas se asemejan a una gripe pudiendo incluir fiebre, mialgia, artralgia, dolor de cabeza, náuseas, vómito y diarrea. De producirse hemorragias, estas suelen ocurrir durante las segunda semana y se limitan a ser nasales, conjuntivas oculares y/o en las encías, aunque en casos severos y menos comunes se producen hematomas, metrorragia, hematuria, melena y otros síntomas hemorrágicos. Después de la segunda semana, más del 80% de los pacientes se recuperan. Sin tratamiento, la enfermedad puede llevar al paciente a la muerte, siendo la tasa de mortalidad del 30% para estos casos [revisado en (Gomez et al., 2011)].

Diagnóstico

El diagnóstico de la FHA se basa en información clínica y de laboratorio. Un número de plaquetas menor a 100000/mm3 en combinación con un número de células blancas en la sangre inferior a 2500/mm3 para pacientes en áreas endémicas se consideran indicadores útiles para identificar individuos infectados [revisado en (Gomez et al., 2011)]. No obstante, puede establecerse un diagnóstico y la confirmación de la FHA mediante un ensayo RT-PCR (del inglés, reverse transcription polymerase chain reaction) [revisado en (Gomez et al., 2011)].

Tratamiento

El tratamiento se basa en medidas que mantengan la homeostásis del paciente. La transfusión de plasma de pacientes convalescientes en dosis de 3000 unidades/kg peso) de anticuerpos neutralizantes durante la fase inicial de la FHA reduce la mortalidad a menos del 1% (Enria et al., 2008).

Prevención

En la década de 1990 se introdujo una vacuna contra la FHA, que emplea la cepa atenuada Candid 1 (C#1). Esta vacuna resultó muy efectiva para reducir la tasa de infección y prevenir el desarrollo de la FHA (Enria et al., 2008). Sin embargo, la vacuna por ser a virus atenuado, no puede emplearse en embarazadas ni inmunodeprimidos y la FHA persiste como una infección potencialmente letal y por lo tanto reviste interés nacional.

Macrófagos

Los macrófagos son células del sistema inmunitario derivadas de monocitos de sangre periférica o PBMCs (del inglés, Peripheric Blood Mononuclear Cells) los cuales migran hacia un tejido en respuesta a un estímulo inflamatorio. Como todas las células hematopoyéticas, se originan de una célula precursora madre en la médula ósea, la cual puede diferenciarse hasta monocitos, que son liberados al torrente sanguíneo (Gordon, 2007).

Los macrófagos tienen una alta capacidad fagocítica, la cual se encuentra ligada a su función como célula presentadora de antígenos. Se consideran las células con mayor plasticidad del sistema hematopoyético, y se encuentran en todos los tejidos. Además los macrófagos presentan distintos perfiles transcripcionales y habilidades funcionales, requeridos para el mantenimiento de la homeostásis del organismo (Gordon, 2007).

La función característica de los macrófagos es la fagocitosis para eliminar células apoptóticas, células dañadas o tumorales, residuos celulares, partículas extrañas inanimadas y microorganismos (Gordon, 2007). Este proceso puede acelerarse por la opsonización previa de dicho elemento, en la cual el elemento a fagocitarse se recubre de moléculas que facilitan el reconocimiento de receptores en la superficie del macrófago y favorecen el proceso de fagocitosis.

Una vez dada la fagocitosis, el fagosoma resultante se fusiona con lisosomas primarios generando los fagolisosomas. Es dentro de los fagolisosomas donde diferentes enzimas, como hidrolasas ácidas, peroxidasas y lisozimas y sustancias reactivas de oxígeno, como peróxido de hidrógeno, terminan degradando el material fagocitado. Los péptidos degradados pueden llegar a unirse a moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) de clase II, después de lo cual se direccionarán a la superficie para dar lugar a la sinápsis inmunológica con células T y así comenzar una respuesta inmunitaria específica (Wynn et al., 2013).

La activación de los macrófagos tiene varios efectos en estas células. Principalmente, la activación por linfocitos Th1 le permite a los macrófagos potenciar su capacidad fagocítica y a su vez activar diferentes factores de transcripción generándose citoquinas como interferones (IFN-I e IFN) y el factor de necrosis tumoral (TNF-alfa) en conjunto con diversas moléculas de superficie (Mills, 2015).

Debido a su función central, tanto en la respuesta inmunitaria innata y su rol en la respuesta inmunitaria adaptativa, los macrófagos poseen un rol central en la respuesta antimicrobiana. No sorprende, por lo tanto, que varios patógenos hayan desarrollado estrategias para contrarrestar las propiedades inmunitarias de los macrófagos (Gordon, 2007).

Antecedentes del estudio

La infección exitosa de varios virus requiere diferentes mecanismos de evasión de la respuesta inmune. Por ejemplo, la infección de células inmunitarias como células dendríticas y su posterior modulación permitirían inhibir mecanismos antivirales del organismo y/o favorecer una respuesta inmune contraria a la contraproducente para la replicación viral. Los macrófagos son células del sistema inmune críticas para el control de infecciones, de manera que podrían servir de blancos de infección.

Estudios previos con los virus Mopeia (MOPV) y Lassa (LASV), ambos pertenecientes a la familia arenaviridae al igual que el virus Junín, mostraron que, aunque para ambos virus hay replicación en células macrofágicas, LASV no generaba activación en macrófagos humanos, a diferencia de MPOV, que si lo hacia. Para los Arenavirus de Nuevo Mundo se conoce menos respecto al impacto de su infección en la respuesta inmune humana mediada por macrófagos.

Para estudiar el efecto en macrófagos de la infección con Virus Junín se utilizaron dos cepas: la cepa vacunal Candid 1 (C#1) y la cepa patogénica P3441 (P).

Materiales y Métodos

Células

Las células BHK-21 y Vero-76 (ATCC, EE. UU.) se mantuvieron como monocapas como se describió anteriormente (De Giusti et al., 2015). Los macrófagos derivados de monocitos humanos (HMDM) se obtuvieron como se informó anteriormente (Kusne et al., 2014). Brevemente, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (GE), y se realizó una selección positiva de monocitos CD14 + usando un Kit de selección positiva CD14 humana EasySep ™ (StemCell Tech, Vancouver, Canadá). La diferenciación de los macrófagos se realizó colocando 2,5 x 105 monocitos CD14 + en placas de 48 pocillos que contenían 500 µL de RPMI 1640 más 10% de FBS y 1% de PS en presencia de rM-CSF (40 ng / ml) y se cultivaron durante 7 días. En experimentos seleccionados, se usaron placas de 24 pocillos con doble cantidad de células y medio.

Virus

Ya se ha descrito la cepa virulenta de JUNV originalmente aislada de un paciente con FHA (P3441), así como la cepa Candid 1 atenuada (C # 1)(Negrotto et al., 2015). La preparación de reservas virales en células BHK-21 y la titulación de infectividad usando la línea celular Vero-76 se ha descrito previamente (Negrotto et al., 2015).

Reactivos

El MEM, RPMI y suero fetal bovino se compraron de Invitrogen (Argentina). rM-CSF fue adquirido de R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.). Los anticuerpos anti JUNV se obtuvieron de recursos de BEI, EE. UU. Anti CD71, CD14, CD86, CD80, HLA-DR, CD11b, CD11c, CD64, CD163, CD206 se obtuvieron de BioLegend (San Diego, CA, EE. UU.). Anti-humanos APC-MERTK (IgG1 de ratón), Biotin-AXL (IgG de cabra) y controles de isotipo se obtuvieron de R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.). Anti-TYRO3 (IgG de conejo) se obtuvo de Novus Biological (Littleton, CO, EE. UU.). DAPI fue comprado de Invitrogen (Argentina). Los kits de ELISA para TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 e IL-12 se obtuvieron de eBioscience, Ready Set Go). El kit Cytofix / Cytoperm se adquirió en BD Bioscience (San Diego, CA, EE. UU.).

Infecciones celulares

Para la infección viral, las células se lavaron con PBS dos veces antes de incubar con el virus a una multiplicidad de infección (MOI) de 1 en medio sin suero. Después de 1 h de incubación a 37 ° C, las células se lavaron con PBS dos veces más y se suplementaron con un medio de cultivo completo. Se realizó una infección simulada añadiendo a la monocapa celular el mismo volumen de sobrenadante de cultivo celular BHK-21 en lugar de JUNV. Las células se observaron diariamente usando un microscopio invertido con una cámara Olympus SP-320 y se procesaron adicionalmente con el software Photoshop 6.0.

Estudios de inmunofluorescencia indirecta

Las células se cultivaron en insertos de vidrio de 12 mm de diámetro antes de la infección viral. En el punto de tiempo indicado, los insertos se fijaron con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 20 minutos y se permeabilizaron con Tween al 0,1% durante 10 minutos. Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C con un conjunto de anticuerpos monoclonales específicos contra JUNV (Negrotto et al., 2015). Luego se aplicaron Igs anti-ratón conjugados con FITC a los portaobjetos lavados con PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT). Los anticuerpos se diluyeron con PBS que contenía suero bovino fetal al 5% y suero de cabra al 5% como reactivos de bloqueo. Los portaobjetos se contratiñeron con DAPI y se examinaron bajo un microscopio Nikon E200 equipado con filtros de fluorescencia y una lámpara de mercurio de 100 W. Las imágenes se adquirieron con una cámara refrigerada Tucsen TCC 5.0 bajo el control del software IS listen y se procesaron con el software Photoshop 6.0.

Análisis de citometría de flujo.

La tinción de superficie para CD11b, CD64, CD206, CD14 (caracterización fenotípica de macrófagos) o CD11b, HLA-DR, CD86 y CD80 (estado de activación) se realizó siguiendo el protocolo estándar. Brevemente, las células cosechadas se lavaron con PBS y se bloquearon en PBS más FBS al 2% (PBSF) en hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron con PBS y los cócteles de Abs respectivos (preparados en PBSF) se añadieron al sedimento celular y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Se usó un tinte de viabilidad reparable de acuerdo con las instrucciones del fabricante para activar las células vivas. Después del lavado, las células se fijaron con un kit Cytofix / Cytoperm (BD Biosciences), se lavaron nuevamente y se analizaron en un citómetro de flujo FACS Canto I (Becton Dickinson) o Partec-Sysmex CyFlow (Görlitz, Alemania). Todos los análisis se llevaron a cabo con el software FlowJo (Tree Star). La tinción intracelular se realizó siguiendo las recomendaciones del fabricante para Cytofix / Cytoperm Kit. El bloqueo y la preparación de anticuerpos de cóctel se realizó con PBSF.

Ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA)

Los niveles de IL-6, IL-12, TNFα e IL-10 se evaluaron en sobrenadantes de cultivo con kits ELISA Ready-SET-Go (e-Bioscience) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Aislamiento de ARN, RT-PCR y PCR en tiempo real

Para el análisis de la expresión génica, las células de cultivo se lavaron y luego se cosecharon con Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se obtuvo ARN total siguiendo las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó utilizando 100 ng de ARN empleando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Las reacciones de qPCR se evaluaron usando 1 µl de ADNc y usando Sso Advanced Universal mix con Sybr Green y equipos CFX-Connect (Biorad, EE. UU.). La reacción se normalizó a los niveles de expresión génica de mantenimiento y la especificidad de los productos amplificados se verificó mediante análisis de curvas de disociación.

Análisis estadístico

Todos los resultados se expresan como la media ± SEM. Se usó una prueba t pareada de Student para determinar diferencias significativas entre las medias de 2 grupos, y los valores de P inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Cuando se compararon varios grupos, se utilizó un análisis de varianza de uno o dos sentidos (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey o Fisher para determinar diferencias significativas entre los grupos. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software Prism 6 (GraphPad). Cada experimento se realizó con 3-4 donantes diferentes.

Resultados

Las dos variantes de JUNV replican similarmente en macrófagos humanos

Las células macrofágicas derivadas de monocitos humanos HMDM (del inglés, human monocyte-derived macrophages) fueron infectadas con una multiplicidad de infección = 1 para la cepa atenuada Candid 1 o la cepa patogénica P. Las células HMDM mostraron cambios morfológicos claros, tales como el aplanamiento y extensión, tan temprano como a las 24 horas posinfección para ambas cepas de JUNV (figura 1A). El título de virus infeccioso liberado en el sobrenadante fue medido a lo largo de 6 días por el ensayo de formación de placas.

La infección con ambas cepas virales llevaron a niveles similares de virus infecciosos, alcanzando un pico a los 3 días posinfección y decayendo hasta el final del estudio (Figura 1B). Un antígeno viral fue estudiado a los 3 días posinfección por inmunofluorescencia (IF) y citometría de flujo (FC). El teñido de proteína viral fue similarmente positivo para ambas cepas (Figura 1C). Como se esperaba, el análisis de FC confirmo que estos resultados mostraban que un 58% de las células HMDM eran infectadas con la cepa C#1 mientras que el 57.6% eran positivas para la cepa P (Figura 1D).

Figura 1. Los macrófagos humanos son igual de susceptibles a las dos variantes de JUNV. Células macrofágicas derivados de monocitos humanos (HMDM) fueron infectados a una multiplicidad de infección igual a 1 con la cepa atenuada C#1 y la cepa patogénica P de JUNV. (A) Observación de la morfología celular. Células infectadas con JUNV son más aplanadas y extendidas. (B) Titulación Viral de sobrenadantes de células realizados en células virales durante 6 días por medio de un método estánda de Unidades Formadoras de Placas (PFU). (C) Antígenos Virales fueron detectados por immunofluorescencia con un pool de anticuerpos y anti-JUNV-FITC, y los núcleos fueron contra-colorados con DAPI. (D) Células HMDM fueron infectadas con cepa C#1 o P y a los 3 días post-infección fueron tenidas con anti-JUNV-FITC y el porcentaje de células con antígeno viral positivo fueron analizadas por citometría de flujo. El porcentaje de células infectadas fue comparados usando el ANOVA No Paramétrico de una dirección seguido del test de comparación múltiple de Dunn. Los resultados fueron graficados como la media (min-máx, la línea horizontal indica la media). Al menos tres donantes independientes fueron usados para cada ensayo.

Las cepas C#1 y P3441 aumentan la expresión de CD71 de manera diferenciada

Como se mencionó previamente, JUNV utiliza el receptor transferrina humano 1 (hTFR1 o CD71) como receptores de la superficie celular para ingresar a la célula. Estudios anteriores demostraron que la infección de JUNV aumenta la expresión de hTFR1 en células precursoras CD34+, lo que sugiere que la infección viral promueve su propia diseminación (Pozner et al., 2010). Por medio de citometría de flujo se observó que la infección de JUNV en macrófagos humanos incrementa la expresión de CD71, siendo más pronunciado en la infección con la cepa P (Figuras 2A-C).

Figura 2.| JUNV aumenta la expresión de CD71 en macrófagos humanos, siendo mayor ante la infección con P. Células HMDM fueron infectadas a multiplicidad de infección (MOI = 1) con la cepa C#1 o P de JUNV. Después de 3 días post-infección, las células fueron doble-teñidas con anti-JUNV y anti-CD71 y analizadas por citometría de flujo. (A) Dot-plots representativos mostrando señal positiva para antígeno viral en macrófagos. (B) Histograma representativo mostrando la expresión de CD71 después de gating en células positivas para antígeno JUNV y controles negativos. (C) Nivel de expresión de CD71 analizado como promedio de intensidad fluorescente (MFI) en el gráfico. Las diferencias significativas entre grupos fue detectado usando el ANOVA No Paramétrico de una dirección seguido del test de comparación múltiple de Dunn, *P < 0,05. Los resultados fueron graficados como la media (min-máx, la línea horizontal indica la media) de al menos cuatro donantes independientes por ensayo.

La producción de citoquinas y activación de macrófagos difiere luego de la infección entre las cepas C#1 y P

Se analizó el patrón de expresión de marcadores de co-estimulación como CD80 y CD86, y el marcador de superficie de presentación de antígeno (HLA-DR). Los resultados muestran que la expresión difiere entre una cepa y otra. Porcentajes mayores de células CD14+CD86+ fueron observadas después de infectar con la cepa C#1, mientras que CD80 no mostró diferencias significativas entre células infectadas. Al mismo tiempo, macrófagos infectados con la cepa P mostró los mayores porcentajes de células CD14+ HLA-DR++ (figuras 3A-B).

Considerando la activación inducida por la infección de JUNV en macrófagos observada, se analizó el nivel de varias citoquinas en los sobrenadantes de HMDM a los 3 días posinfección. Encontramos un perfil distintivo claro, dado que mayores niveles de TNF-a, IL-10 y IL-12 fueron detectadas en los sobrenadantes de macrófagos infectados con C#1 mientras que sólo IL-6 mostró niveles aumentados usando la cepa P. Notablemente no hubo diferencia significativa en la producción de IL-1, en comparación con las condiciones de mock (figuras 3C-G). El porcentaje de células viables no mostró diferencias significativas comparándose Mock, C#1 y P, aunque pequeños incrementos en células AnnV+ fueron observadas con P cuando se compararon con C#1 y Mock.

Figura 3. JUNV activa macrófagos humanos y modula selectivamente la producción de citoquinas. Células HMDM fueron infectadas con cepas C#1 o P de JUNV (MOI = 1) y a los 3 días posinfección fueron evaluadas la expresión de activación y co-estimulación CD80, CD86 o el presentador de antígeno HLA-DR en células CD14+ por citometría de flujo. (A) Dot-plots representativos mostrando CD14+ y cada marcador. (B) El porcentaje de doble positivas CD14+CD86+, CD14+CD80+ y CD14+HLA-DR++ están graficadas. El umbral fue establecido para cada marcador basado en el FMO. La expresión de TNF-a e IL-1b (C), IL-12 (D), IL-10 (E). IL-6 (F) e IL-1b (G) fueron medidos en el sobrenadante de macrófagos infectados a las 72 horas, utilizando kits comerciales de ELISA. Las diferencias significativas entre grupos fue detectado usando el ANOVA No Paramétrico de una dirección seguido del test de comparación múltiple de Dunn, *P < 0,05, **P < 0,01. Los resultados fueron graficados como la media (min-máx, la línea horizontal indica la media) de al menos cuatro donantes independientes por ensayo.
 

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