La lecitina biomimética promueve la actividad y la complejidad de la red neural

► Introducción

La lecitina biomimética es una combinación de ácido docosahexaenoico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido araquidónico, ácido linoleico y ácido linolénico, en conjunto con otros ácidos grasos esenciales saturados, monosaturados y poliinsaturados (15 ácidos grasos diferentes), que por su homología estructural con los ácidos grasos de la membrana plasmática neuronal participan en el desarrollo del cerebro y en la función neuronal. En particular, los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA, polyunsaturated fatty acid), DHA y EPA, son fundamentales en la síntesis de la membrana neuronal (el DHA permite el aumento de los valores de ácido fosfatídico y de proteínas sinápticas) y en la formación de las sinapsis (incrementan el número de espinas dentríticas en las neuronas del hipocampo). De esta manera, estos PUFA, pertenecientes a la serie n-3 (omega 3), permiten al cerebro nutrirse con compuestos esenciales ricos en ácidos grasos, como la esfingomielina (fosfolípido glicerolado) y los fosfolípidos, que presentan en su estructura fosfatidil etanolamina, fosfatidil colina, fosfatidil serina y fosfatidil inositol, los cuales son claves en la neurotransmisión (fusión y reciclaje de vesículas sinápticas). Al participar en los mecanismos antes mencionados, los PUFA promueven la maduración de la neurona (arborización dendrítica y ramificación axonal), ya que favorecen la estabilidad sináptica y regulan el crecimiento y la extensión de las neuritas. En este sentido, los cambios estructurales y funcionales en los cuales se encuentran implicados los PUFA inciden en las capacidades cognitivas y de aprendizaje, en la sinaptogénesis y la plasticidad neuronal.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto que la lecitina biomimética ejerce en la neurotransmisión, el crecimiento y la extensión de las neuritas y la formación de circuitos de neuronas corticales primarias.

► Métodos

Los componentes de los nanoliposomas de lecitina biomimética, denominados F22, fueron extraídos mediante procesos enzimáticos de cabezas de salmones y presentaron similitud estructural a los ácidos grasos y los fosfolípidos con diferentes cabezas proteicas hidrófilas encontrados en el cerebro humano. El F22 (en concentraciones de 5, 50 y 100 µg/ml) fue utilizado en cultivos de células neurales (1.5 x 104células por pocillo de placa de 96) derivadas de embriones de ratón de 18.5 días (medio de cultivo neurobasal suplementado con 12% de B27, 2 ml de glutamina y antibióticos). La actividad metabólica se evaluó de acuerdo con el protocolo del Cell Proliferation kit, en cultivos de 3, 7 y 10 días (el F22 fue aplicado al cultivo luego de 6 horas de crecimiento). La determinación de la ramificación de las neuritas y la complejidad de la red neuronal se realizó mediante la utilización del anticuerpo que detectaba beta-III tubulina (marcador de citoesqueleto) y el análisis morfométrico de Sholl, respectivamente. En los experimentos de electrofisiología, las neuronas corticales primarias (1 x 105) fueron cultivadas sobre matrices de microelectrodos (MME) en medio de cultivo específico. Con respecto a la actividad eléctrica detectada por los electrodos, se estableció que éstos debían registrar un mínimo de 3 espigas por minuto para ser considerados activos. Por otra parte, la frecuencia de estallidos de actividad fue determinada por el número de estallidos por minuto registrados por electrodos activos (los cuales registraban un mínimo de un estallido por minuto) y, asimismo, un estallido de actividad estaba representado por un mínimo de 4 espigas.

Para el análisis de expresión se extrajo el ARN total y se lo trató con ADNasa I. Se obtuvo el ADN copia a partir de 0.5 µg de ARN total de acuerdo con el protocolo de High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Manual. Se procedió luego a realizar una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real con los primers específicos para sinapsina I y GAPDH y HPRT1 como controles internos.

En el análisis estadístico se utilizó ANOVA de una vía y el método de Bonferroni (actividad metabólica), la prueba de la t de Student (análisis Sholl), y ANOVA de dos vías y el método de Bonferroni (experimento de MME). Un valor de p < 0.05 fue considerado estadísticamente significativo, determinado por la prueba de la t de Student de muestras relacionadas.

► Resultados

Los nanoliposomas F22 contenían una mayor proporción (> 50%) de PUFA (30%, 10%, 6% y 5% de DHA, EPA, ácido linoleico y ácido linolénico, respectivamente) y un 20% de ácido oleico (ácido graso monoinsaturado). Asimismo, la fosfatidil colina fue el fosfolípido de mayor representación en los F22 (32% P/P).