Prevalencia del polimorfismo I/D del gen de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) en la población de Montevideo

Departamento de Citogenética, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable.

1 Investigador honorario. Departamento de Citogenética, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE).
2 Asistente DT. Departamento de Citogenética, Unidad Asociada al Instituto de Biología. Facultad de Ciencias. Investigadora Asociada. Departamento de Citogenética, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable.
3 Becaria. Departamento de Citogenética, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable.
4 Coordinador de la Unidad de Diabetología del CASMU.
5 Investigador Jefe. Departamento de Citogenética, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable.

Correspondencia: Dra. Adriana Mimbacas. Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable. Av. Italia 3318. Montevideo, Uruguay. E-mail: abmg@iibce.edu.uy

Las nuevas técnicas de biología molecular aplicadas al diagnóstico genético y el uso de marcadores moleculares posibilitan el estudio de los mecanismos que subyacen en la predisposición individual y familiar a padecer determinadas enfermedades siendo, en todos los casos, necesario establecer previamente cuál es la prevalencia de dichos marcadores en la población general.
Uruguay presenta algunas particularidades desde el punto de vista poblacional que lo diferencian del resto de los países latinoamericanos. Es una población de origen trihíbrido (europeo, africano y amerindio) con un intenso proceso de miscegenación y no presenta, desde la mitad del siglo XVIII, grupos amerindios aislados(1). Estudios realizados en nuestro laboratorio sobre fibrosis quística, enfermedad celíaca y diabetes mellitus, mostraron que el comportamiento de los genes fue diferente según la enfermedad estudiada, siendo fuerte la influencia de la mezcla étnica en ciertos marcadores y comportándose como una población caucásica en otros, pero, en general, diferente al resto de los países latinoamericanos(2-7). El gen de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) se expande a lo largo de 21 kb, (26 exones y 25 intrones), se ubica en la región cromosómica 17q23(8,9), y pertenece al sistema renina-angiotensina (SRA) junto con los genes de la renina, del angiotensinógeno (AGT), y de los receptores de tipo I y II de la angiotensina II (AGTR1 y AGTR2). La principal función de este sistema es la conversión del angiotensinógeno en angiotensina II por parte de las enzimas renina y ECA(9,10).
Las poblaciones presentan un polimorfismo de inserción/delección (I/D) para este gen, que involucra la presencia (alelo I), o la ausencia (alelo D) de una secuencia Alu repetida de 287 pares de bases en el intrón 16(11). Estas variantes tienen como principal efecto una alteración de las concentraciones celulares y plasmáticas de la enzima codificada por este gen, convirtiéndolo en un posible candidato para la susceptibilidad al desarrollo de afecciones tales como la enfermedad cardiovascular y las complicaciones crónicas de la diabetes(12). Estudios acerca de la ECA han demostrado diferencias en sus niveles plasmáticos según el genotipo del individuo: los individuos cuyo genotipo es D/D poseen niveles dos veces más altos que los individuos cuyo genotipo es I/I, mientras que los individuos heterocigotas portan niveles intermedios de la enzima circulante(13,14). Varios estudios acerca de este polimorfismo I/D de la ECA a nivel poblacional demuestran que su prevalencia varía en los distintos grupos étnicos, y que la frecuencia del alelo D es inferior en las poblaciones de origen asiático que en las poblaciones de origen europeo(11). Resulta, por tanto, interesante estudiar al gen que codifica la ECA en nuestra población, ya que podría estar asociado al desarrollo de trastornos vasculares, la principal causa de mortalidad de nuestro país(15).
Basados en estos comportamientos diferenciales de los genes y en las particularidades genéticas de nuestra población, consideramos necesario determinar previamente los datos presentados en este trabajo para realizar estudios epidemiológicos.

Material y método
El estudio se realizó empleando una muestra de 108 individuos seleccionados del banco de ADN perteneciente al Departamento de Citogenética del Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE). El banco de ADN comprende 500 individuos sin relación de parentesco entre sí, colectado con un diseño estadístico que aseguró
una correcta representación de la población general de Montevideo estratificada por cobertura de salud y nivel socioeconómico. Las muestras fueron elegidas al azar en 15 centros asistenciales públicos y privados de la ciudad de Montevideo (cinco públicos y diez privados).
El diseño estadístico se basó en un estudio sobre nivel socioeconómico y salud pública en la población de Montevideo(16). El número de individuos analizado en cada uno de los 15 centros se determinó sobre la base de seis categorías socioeconómicas arbitrarias establecidas en el mencionado estudio, respetando asimismo las proporciones descriptas en cada categoría a fin de lograr una muestra representativa de la población montevideana total.
La elección de las 108 muestras a analizar se realizó por muestreo aleatorio, siguiendo los mismos criterios que fueron utilizados para el banco de ADN a fin de mantener de esa forma la representatividad poblacional.
Para establecer el genotipo del gen de la ECA se amplificó un fragmento de ADN perteneciente al intrón 16 mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utilizaron dos juegos de cebadores: el primer par flanquea los extremos de la secuencia a amplificar y el segundo par reconoce específicamente la secuencia de inserción. La amplificación por PCR se realizó siguiendo el protocolo utilizado por Hsieh y colaboradores(11).
Los cebadores que se utilizaron en la primera reacción de PCR fueron:
5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’ (1R), y 5’-GATGTGGCCATCACATTGGTCAGAT-3’ (1F).
Los fragmentos amplificados que poseen la inserción (alelo I) y los que no la poseen (alelo D) tienen un tamaño de 480 y 191 pares de bases respectivamente. Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio (5 mg/ml).
Se realizó una segunda amplificación por PCR para confirmar la ausencia de la inserción, utilizando los cebadores 1R (ya descripto) y 2F, cuya secuencia es: 5’ CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’ (2F).

En el caso de la existencia del alelo I se produce una amplificación de 293 pares de bases. En todas las reacciones de PCR se incluyó un control negativo.
Los datos obtenidos fueron analizados utilizando los programas estadísticos STATA 5.0 y Epiinfo 6.0. Se calcularon las frecuencias genotípicas y alélicas. Se realizó el test de Chi cuadrado para detectar si dicha población se encontraba en equilibrio Hardy-Weinberg, y compararla con estudios en otras poblaciones.