O universo oculto do microbioma do leite humano

Antigamente, o leite humano (LH) era considerado estéril. No entanto, a presença de bactérias nunca foi completamente descartada. Os primeiros estudos realizados entre o final do século XIX e início do século XX^1,3 focou na natureza potencialmente nociva do conteúdo bacteriológico do LH, sem considerá-lo, como agora, um recurso precioso. Mesmo assim, no final da década de 1960, a presença de bactérias no LH era considerada consequência de baixos níveis de higiene pessoal e ambiental.⁴

Mais tarde, em 2003, o interesse pela microbiologia do LH ressurgiu com uma nova perspectiva. Com base na detecção de bactérias láticas supostamente endógenas do LH de oito mães saudáveis, foi sugerido que o LH poderia ser considerado um alimento simbiótico, abrigando bactérias seguras com papel potencial na prevenção de doenças infecciosas neonatais.⁵

Ao longo do tempo, o desenvolvimento de técnicas independentes de cultura (por exemplo, reação em cadeia da polimerase quantitativa e sequenciamento de próxima geração - SPG), além das já bem estabelecidas técnicas dependentes de cultura, permitiu a caracterização da composição, diversidade e variabilidade de a microflora LH em maior detalhe, embora com algumas limitações.⁶

Atualmente, o LH é considerado o "protótipo de alimento probiótico da Mãe Natureza".⁷ O aumento das pesquisas sobre o tema tem levado a uma compreensão mais profunda do assunto, descobrindo que o LH é um universo povoado por bactérias, vírus, fungos e leveduras que cooperam para a saúde presente e futura da criança. Essa complexa comunidade microbiana associada ao hospedeiro constitui o microbioma do LH (MLH).

Com isso, Consales e colaboradores (2022) forneceram uma visão geral do que se sabe atualmente sobre a origem, composição, determinantes e papel do MLH, eventualmente sugerindo possíveis direções futuras para pesquisadores que desejam explorar ainda mais este campo.

A origem MLH é um processo complexo e dinâmico, ainda não totalmente compreendido até o momento. Várias fontes, não mutuamente exclusivas, foram sugeridas (Tabela 1). Ainda está em debate se a glândula mamária abriga um microbioma residente (ou seja, modelo de interface mucosa) ou é simplesmente um espectador sujeito a um influxo constante de micróbios de fontes exógenas (ou seja, modelo de influxo constante).

Este último modelo é apoiado pela atual falta de evidência para adesão bacteriana ao epitélio mamário fora de um cenário de mastite e para reprodução bacteriana dentro do tecido mamário. Em contraste, o modelo de interface mucosa é apoiado por evidências de um microbioma mamário pré-lactacional.⁸ No entanto, o fato de o microbioma da glândula mamária não lactante diferir do MLH não permite excluir o modelo de influxo constante.⁹

Embora historicamente o conhecimento do MLH tenha sido limitado a espécies bacterianas¹⁵, evidências recentes destacaram que o LH contém uma ampla variedade de microrganismos, incluindo vírus, fungos e leveduras, e novos gêneros (Tabela 2).

> Bactérias

A implementação de novas técnicas de SPG, como metataxonômica (sequenciamento do gene 16SrRNA) e metagenômica (sequenciamento shotgun), tem permitido a detecção de várias novas espécies bacterianas, inclusive muitas anaeróbicas, totalizando mais de 1.300 espécies diferentes.^{12,16,17 ,22–27}

No entanto, ao tentar determinar o que constitui um bacterioma LH, deve-se considerar a variabilidade interindividual e a localização geográfica do estudo, bem como os métodos utilizados para coleta, armazenamento e análise. Assim, a definição e a própria existência de um bacterioma LH "central" permanece uma questão de debate.²⁸

Por meio da análise genômica, diferentes estudos detectaram uma grande variedade de microrganismos relacionados ao solo e à água, como Bradyrhizobium, Pseudomonas e Stenotrophomonas.^{8,12,16,22,26,29} No entanto, esses resultados devem ser interpretados criticamente, pois tais microrganismos também podem estar contidos em reagentes, soluções e kits de biologia molecular, e seus números relativos podem ser amplificados por técnicas de DNA, contribuindo assim para interpretações errôneas.^22,30–32 Além disso, é fundamental diferenciar entre microrganismos vivos e mortos. Portanto, técnicas apropriadas devem ser selecionadas para limitar possíveis vieses.³³

> Vírus

A maioria (95%)¹⁸ do viroma do LH é composta por bacteriófagos, com vírus eucarióticos e outras partículas virais constituindo uma proporção menor.

O viroma LH tem características distintas que o diferenciam de outros viromas (por exemplo, de fezes adultas, urina, saliva e líquido cefalorraquidiano).^34,35 Em contraste, um número significativo de vírus compartilhados foi identificado entre o viroma LH e as fezes do bebês, apoiando sua herança vertical por meio da lactação.^34,36

Curiosamente, foi observado³⁴ que o viroma nas fezes infantis é mais semelhante ao LH do que nas fezes dos adultos.

> Micobioma e outros‑omas

Os fungos são um componente importante do microbioma humano.³⁷

No entanto, sua presença no LH é uma descoberta relativamente recente.²⁰ Embora seja responsável pela variabilidade geográfica, um micobioma central foi hipotetizado, sugerindo que sua transmissão via LH é uma característica preservada.

Outros microorganismos, até recentemente ignorados, contribuem para o MLH. Em particular, a pesquisa atual tem se concentrado em archaea. A presença de DNA archaeal foi demonstrada em 8/10 amostras de LH analisadas, nenhuma de mulheres com mastite, sugerindo uma função protetora.¹⁷ Em contraste, outros autores não identificaram DNA archaeal nas amostras de LH analisadas.³⁸

O complexo ecossistema LH parece ser moldado ao longo do tempo por muitos fatores: materno, neonatal, ambiental e relacionado ao próprio LH. A natureza extremamente dinâmica da composição do MLH pode explicar os dados muitas vezes conflitantes relatados na literatura. Além disso, deve-se notar que muitos fatores envolvidos na determinação do MLH estão intimamente interligados.

> Determinantes maternos

Alguns autores ^26,39–41 demonstraram que, em comparação com mulheres submetidas à cesariana, amostras de LH de mulheres com parto vaginal apresentaram maior diversidade e riqueza bacteriana, com níveis mais elevados de Bifidobacterium e Lactobacillus spp. No entanto, outros estudos não confirmaram tais resultados.^42,43 Também foi levantada a hipótese de uma influência potencial do modo de aquisição do viroma e do micobioma LH.^44,45

Além disso, estudos demonstraram uma diminuição na abundância de Lactobacillus, Bifidobacterium, Staphylococcus e Eubacterium spp. em amostras de LH de mães que receberam antibióticos perinatais.^8,46,47 A quimioterapia materna durante a lactação também foi associada a uma redução na diversidade bacteriana.⁴⁸

A dieta materna afeta a composição do MLH (presumivelmente mais durante a gravidez do que durante a lactação^49-51).

Os regimes dietéticos de alimentos ricos em fibras e gorduras ⁴⁹, bem como a ingestão de vitaminas (vitamina C e vitaminas do complexo B)⁵¹ demonstraram alterar a composição do MLH. Além disso, tanto o índice de massa corporal (IMC) pré-gravidez quanto o ganho de peso gestacional são refletidos em abundâncias diferenciais de cepas bacterianas (principalmente Streptococcus, Staphylococcus e Bifidobacterium) no LH.^40,52-54

Em comparação com mulheres saudáveis, as mães com doença celíaca têm níveis mais baixos de Bacteroides spp. e Bifidobacterium spp. em seu leite.⁵⁵ Da mesma forma, a mastite determina mudanças na carga bacteriana e na diversidade microbiana do MLH, que desaparecem quando os sintomas clínicos desaparecem.^56-58

O estresse psicossocial pós-natal materno (definido como sintomas de ansiedade, estresse ou depressão durante o período pós-parto) foi associado à diminuição da diversidade bacteriana do LH aos 3 meses pós-parto, com uma diminuição progressiva na abundância relativa de estafilococos e um aumento paralelo de algumas minorias gêneros (Lactobacillus, Acinetobacter e Flavobacterium) em mães com baixo estresse psicossocial.⁵⁹

> Determinantes neonatais

Contagens mais baixas de Enterococcus spp. e mais altas de Bifidobacterium spp. foram detectadas em amostras de LH em mães que deram que deram à luz a termo em comparação com mães com bebês prematuros.³⁹ Em contraste, outros autores⁴² não detectaram nenhuma diferença nos perfis microbianos com base na duração da gestação, postulando um mecanismo à prova de falhas que permite que a mãe esteja "pronta" para transmitir sua marca bacteriana independentemente da idade gestacional ao nascer, como parte de uma pressão evolutiva direcionada para o benefício do bebê. Variações na composição do viroma e micobioma LH com base na idade gestacional e no peso ao nascer foram recentemente demonstradas.^44,45

O efeito do sexo do recém-nascido na composição de MLH60 foi hipotetizado com base na detecção de mais Streptococcus e menos Staphylococcus no LH de mães de meninos em comparação com mães de meninas. No entanto, tais diferenças não foram confirmadas por outros estudos.^42,61

> Determinantes ambientais

A análise de amostras de LH coletadas de populações selecionadas na Europa, África e Ásia sugeriu que a composição do MLH está relacionada à localização geográfica do estudo.⁶² Além disso, a alta variabilidade nos metabólitos do LH foi documentada nos locais de estudo e uma associação entre variações no metaboloma do LH e características específicas do MLH.⁶³ No entanto, uma nova análise de amostras do LH da Etiópia, Gâmbia, Gana, Quênia, Estados Unidos, Peru, Espanha e Suécia demonstrou que, embora as comunidades bacterianas de LB variassem geograficamente, elas continham consistentemente os principais gêneros Staphylococcus e Streptococcus.⁶⁴ Estes os resultados foram confirmados por uma revisão sistemática recente,⁶⁵ que incluiu doze estudos que usaram métodos de cultura independentes para identificar bactérias em nível de gênero no LH de mulheres saudáveis.

Em particular, especulou-se que pelo menos parte da variabilidade geográfica na composição do MLH pode estar relacionada a diferenças no ambiente e no procedimento de coleta, armazenamento e análise do LH.⁶⁶ Quanto aos métodos de coleta, o LH de mães que usam mama foi observado que as bombas⁶¹ têm uma carga microbiana mais alta e uma menor abundância de Staphylococcus cultiváveis ​​em comparação com amostras de LH coletadas manualmente. Em contraste, outros autores não encontraram diferenças na diversidade ɑ entre as amostras coletadas por extração manual ou por bombeamento com um dispositivo estéril de uso único.⁶⁷

A análise de MLH de mulheres que vivem na mesma região, mas com estilos de vida diferentes (tradicional vs. ocidental), revelou que as amostras do LH de "mulheres rurais" tinham maior diversidade e maior abundância de linhagens bacterianas subdominantes do que as de "mulheres urbanas".⁶⁸

Um estudo realizado na República Centro-Africana em uma sociedade de pequena escala sugeriu que a sazonalidade pode influenciar a abundância relativa de táxons específicos no MLH, embora possa ser difícil determinar se a variação na composição depende de diferenças na exposição ambiental sazonal e/ ou variação sazonal na dieta.⁶⁹ O mesmo estudo⁶⁹ explorou a relação entre o tamanho da rede de relacionamento social mãe-bebê e a composição e diversidade do MLH, mostrando como o LH de mães com redes maiores e bebês com mais cuidadores, teve maior uniformidade microbiana (mas não riqueza microbiana) do que LH de mães cujos bebês tiveram menos cuidadores.

Cabrera-Rubio et al.²⁶ foram os primeiros a descrever as mudanças que o MLH sofre ao longo do tempo, do colostro ao leite de transição e maduro. Esses autores relataram uma abundância progressivamente maior de habitantes orais típicos (por exemplo, Veillonella, Leptotrichia e Prevotella spp.) no LH de transição e maduro, e contagens mais altas de Bifidobacterium posteriormente na lactação. Outros autores³⁹ posteriormente relataram maior influência do estágio de lactação nas contagens de Bifidobacterium e Enterococcus spp., que apresentaram aumento progressivo de sua concentração do colostro ao LH maduro, como Lactobacillus e Staphylococcus spp.

Diferentes padrões foram descritos ao longo do tempo. Ao analisar amostras de LH coletadas em 3 pontos de tempo durante um intervalo de 4 semanas, um conjunto de 9 "Unidades Taxonômicas Operacionais Básicas" foi identificado.¹⁶ No entanto, em algumas amostras, as comunidades bacterianas de LH foram bastante consistentes, enquanto em outras, a abundância relativa de gêneros bacterianos mudou ao longo do tempo.¹⁶

Para o micobioma, um estudo recente⁴⁵ analisou amostras de LH de diferentes fases da lactação e constatou que, em amostras de LH de transição, Saccharomyces cerevisiae e Aspergillus glaucus foram as espécies mais abundantes, enquanto Penicillium rubens e Aspergillus glaucus predominaram em amostras de LH maduro.

Especula-se que outros componentes do LH, como oligossacarídeos do LH (OLHs), ácidos graxos, hormônios, células imunológicas e anticorpos, possam modular a composição do MLH.^70,71 Em particular, os OLHs podem promover o crescimento de Staphylococcus spp. na glândula mamária lactante.⁷²

Quando o leite materno não está disponível ou é insuficiente, o LH doado (DLH) é a próxima melhor alternativa.^73-75 No entanto, a pasteurização, necessária para garantir os padrões de segurança microbiológica, inevitavelmente inativa vários dos nutrientes e biológicos do LH,⁷⁶ incluindo o MLH. Na verdade, a pasteurização mata a maioria das bactérias no leite (exceto as espécies de Bacillus formadoras de esporos).^77-79

No entanto, a viabilidade do MLH não é mais considerada essencial. De fato, foi levantada a hipótese de que o efeito probiótico de micróbios benéficos no LH depende da capacidade das células hospedeiras de reconhecer componentes ou produtos bacterianos específicos, ativando assim o sistema imunológico. Essas células microbianas “não viáveis ​​(na maioria das vezes inativadas pelo calor)” (intactas ou rompidas) ou extratos celulares brutos (ou seja, ácidos nucleicos, componentes da parede celular) são conhecidos como para-probióticos ou probióticos fantasmas⁸⁰.

O MLH semeia o trato gastrointestinal infantil com bactérias pioneiras, contribuindo assim para o estabelecimento da microbiota oral e intestinal infantil.^81,82 No entanto, nem todas as bactérias presentes no LH são encontradas no intestino infantil, mas apenas algumas poucas parecem colonizar o recém-nascido.⁴² No entanto, foi levantada a hipótese de que a exposição transitória pode ser tão eficaz quanto a colonização persistente.^83,84 Além disso, as bactérias no LH podem regular positivamente fatores protetores, como anticorpos, células imunes, lactoferrina e beta-defensinas que então ser transmitido ao recém-nascido através da lactação.⁴² O viroma LH, especialmente os bacteriófagos, provavelmente também contribui para a ecologia intestinal do lactente.¹⁸

A exposição microbiana precoce é essencial para fornecer estímulos antigênicos que promovem a maturação do sistema imunológico intestinal, promovendo uma mudança do meio imunológico predominante de células T auxiliares (TH) 2 intrauterinas para uma resposta TH1/TH2 equilibrada e desencadeando a diferenciação de células T reguladoras.⁸⁵

Por meio de modificações da microbiota intestinal infantil e por meio do eixo intestino-cérebro, o MLH também pode influenciar o desenvolvimento de um fenótipo comportamental mais desejável na prole, como tem sido sugerido para outros bioativos do LH.⁸⁶ De fato, na primeira infância, o LH pode promover a colonização de uma microbiota específica que influencia a regulação do biocomportamento da prole. Uma microbiota intestinal infantil orientada para o leite pode produzir um fenótipo comportamental energeticamente menos dispendioso para alocar de forma mais otimizada o investimento de energia materna.⁸⁶

Uma associação entre amamentação e composição da microbiota do trato respiratório superior foi relatada em 6 semanas, com bebês amamentados mostrando uma composição microbiana significativamente diferente de bebês alimentados com fórmula.⁸⁷ Curiosamente, tal associação parece desaparecer por volta dos seis meses de idade (ao desmamar normalmente começa).^87,88

Finalmente, foi levantada a hipótese de que o MLH também pode beneficiar a mãe, protegendo-a contra infecções como a mastite.⁴²

A amamentação representa uma rota valiosa de transmissão de micróbios maternos tanto em humanos quanto em outros animais (por exemplo, macacos rhesus, vacas, ovelhas, cabras).^89-92 Dado que a transmissão do MLH pode ser uma característica conservada entre diferentes espécies, pode-se hipotetizar um possível propósito evolutivo.

A transmissão microbiana materna fornece à prole micróbios importantes no início da vida, em vez de deixar sua aquisição ao acaso durante os estágios posteriores do desenvolvimento. Ao moldar o próprio microbioma da prole, tais micróbios podem determinar vantagens evolutivas no receptor.^11,93,94 Consequentemente, dentro de um contexto evolutivo mais amplo, a transmissão MLH pode ser vista como pelo menos parcialmente capaz de moldar o microbioma de toda a espécie ao longo do tempo evolutivo, pois os micróbios promotores de aptidão do hospedeiro aumentarão suas chances de alcançar a próxima geração.

Apesar dos progressos alcançados nas últimas décadas, muitas questões ainda precisam ser respondidas. No entanto, a falta de "melhores práticas" reconhecidas internacionalmente na análise de MLH (por exemplo, coleta, armazenamento e processamento de LH, extração de DNA e sequenciamento) muitas vezes limita a comparação entre os estudos. Portanto, desenhos de estudo rigorosos e padronizados são necessários para promover a precisão e a reprodutibilidade dos resultados.

Muitas das questões abordadas na revisão representam campos interessantes para explorar. Primeiro, as fontes e vias de semeadura de MLH precisam ser examinadas mais a fundo, possivelmente por meio de estudos experimentais em modelos animais. Além disso, as interações entre a mãe, o bebê e o ambiente precisam ser mais investigadas, desvendando mecanismos ocultos de co-regulação entre diferentes microbiomas. Também, todos os membros da comunidade microbiana do LH devem ser igualmente considerados. Até agora, as bactérias foram os microorganismos mais estudados.

Progressivamente, a atenção mudou para os vírus (embora com uma forte tendência para os vírus de DNA), fungos e leveduras. A próxima fronteira será explorar o arqueoma e obter informações sobre as possíveis implicações para a saúde infantil dos componentes "menores" do MLH. Finalmente, o significado funcional do MLH e seu impacto no microbioma do trato gastrointestinal, no sistema imunológico e, posteriormente, na saúde dos bebês se beneficiariam de estudos experimentais apropriados, possivelmente longitudinais.

As implicações práticas e translacionais da pesquisa MLH também devem ser consideradas. Por exemplo, estudos sobre a reconstituição do DLH devem ser incentivados por meio da inoculação de quantidades definidas do próprio leite materno do lactente com o objetivo de restaurar a MLH viva, conforme descrito por Cacho et al.⁹⁵ Da mesma forma, o possível papel da suplementação dietética materna com pré ou pós-bióticos destinados a modular o MLH, bem como o momento mais adequado para tal suplementação (por exemplo, durante a gravidez e/ou durante a lactação).

Tradicionalmente, o leite humano era considerado estéril. No entanto, com o passar do tempo e o desenvolvimento de novas tecnologias, a caracterização da composição, diversidade e variabilidade da microflora LH foi alcançada com mais detalhes. Atualmente, o LH é considerado um universo vivo constituído por uma complexa comunidade microbiana de bactérias, vírus, fungos e leveduras que compõem o microbioma e cooperam para a saúde presente e futura da criança. A revisão de Consales e colaboradores (2022) forneceu uma visão geral da origem, composição, determinantes e papel do microbioma do leite humano e sugeriu possíveis direções para pesquisas futuras neste campo.

Tabela 1: Resumo das principais fontes hipotéticas do MLH.

Tabela 2: Composição do microbioma do leite humano

Resumo, tradução e comentário objetivo: Dra. María Eugenia Noguerol