A exposição ao frio prejudica a imunidade antiviral nasal mediada por pool de vesículas extracelulares

O trato respiratório superior humano é o primeiro local de contato para vírus respiratórios inalados e para combatê-los, o organismo gera uma série de respostas imunes inatas. A variação sazonal nas infecções virais respiratórias e a importância da temperatura ambiente na modulação das respostas imunes às infecções são bem reconhecidas; no entanto, os mecanismos biológicos subjacentes permanecem pouco estudados.

Para abordar essa lacuna, Huang e colaboradores (2022) investigaram o papel das vesículas extracelulares (VEs) derivadas do epitélio nasal na imunidade antiviral inata dependente do receptor Toll-like 3 (TLR3).

Foram avaliadas a secreção e composição de VEs epiteliais nasais após estimulação TLR3 em células autólogas humanas e espécimes cirúrgicos frescos de mucosa nasal humana. Ademais, os pesquisadores exploraram a atividade antiviral e os mecanismos de VEs estimulados por TLR3 contra vírus respiratórios, bem como o efeito da temperatura ambiente fria na imunidade antiviral.

Após as análises, Huang e colaboradores (2022) confirmaram que as VEs purificadas exibiram o marcador CD81 e careciam da expressão dos marcadores de proteína do retículo endoplasmático, calnexina e GRP94, bem como do marcador de Golgi GM130. A exposição ao ácido poliinosínico: policitidílico, também conhecido como poli (I:C), induziu um aumento semelhante a um enxame na secreção das VEs epiteliais nasais por meio da sinalização TLR3.

Após a confirmação de que a estimulação do TLR3 aumentou a secreção das VEs derivadas do epitélio nasal, os pesquisadores investigaram se exibiriam atividade antiviral intrínseca. Descobriram que a exposição a VEs estimulados por TLR3 resultou em uma redução significativa nos níveis de mRNA do vírus intracelular em relação a células não tratadas infectadas com o mesmo título de vírus, indicando replicação viral suprimida. Além disso, as VEs estimuladas por TLR3 bloquearam a infecção de maneira dependente da dose.

Após demonstrarem que as VEs estimuladas por TLR3 exibiram atividade antiviral contra vários vírus respiratórios comuns, os autores exploraram os potenciais mecanismos antivirais com foco no papel dos microRNAs (miRNAs), as quais são moléculas de RNA fita simples de 19-25 nucleotídeos, não codificadores de proteínas, que agem como potentes reguladores pós-transcricionais da expressão gênica. Os níveis de expressão de miRNA nas amostras das VEs estimuladas com TLR3 foram diferentes das amostras controle. Houve um aumento da expressão de miR-17, responsável por suprimir a replicação viral durante a infecção.

Como as VEs demonstraram anteriormente inibir infecções bloqueando a ligação da proteína do vírus com seu receptor celular nas células hospedeiras, os pesquisadores analisaram os níveis de LDLR, ICAM-1 e ácido N-acetilneuramínico (NANA), que estão envolvidos na endocitose mediada por receptores de rinovírus 1B (RV-1B), rinovírus 16 (RV-16) e betacoronavírus 1 (CoV_OC43), respectivamente. Os resultados demonstraram a estimulação TLR3 significantemente regulou positivamente o LDLR em EVs tanto no nível transcricional quanto em comparação com controles não estimulados  sugerindo que a estimulação de TLR3 promove o encapsulamento das proteínas receptoras de superfície dentro das EVs. Além disso, a estimulação induziu uma abundância de ICAM-1 e LDLR nas VEs. O NANA foi indetectável, tanto no controle, quanto nas vesículas extracelulares estimuladas, no entanto a sua quantidade intracelular aumentou significativamente após a estimulação de TLR3.

Ademais, os pesquisadores descobriram que as VEs estimuladas por TLR3 exibiram efeitos antivirais mais robustos quando foram pré-incubados com vírus por uma hora a 37^oC antes da exposição às células hospedeiras receptoras em relação à co-incubação. Isso sugeriu que as interações podem suprimir as infecções virais funcionando como chamarizes, evitando assim que o vírus se ligue ao seu receptor celular nas células hospedeiras.

Sendo assim, as VEs participaram da imunidade antiviral dependente de TLR3, protegendo o hospedeiro de infecções virais por meio da entrega funcional mediada por EV de miR-17 e neutralização direta do vírion após a ligação aos ligantes do vírus por meio de receptores de superfície, incluindo LDLR e ICAM-1.

> A exposição ao frio prejudica a secreção das VEs dependente de TLR3 e a abundância de miR-17, que anula a atividade antiviral

Os pesquisadores demonstraram que as VEs estimuladas por TLR3 produzidas a 37^oC foram mais eficientes na inibição das infecções virais do que quando produzidas as 32^oC. Na temperatura mais alta, houve um aumento na expressão de miR-17. Ademais, a expressão dos genes e proteínas de LDLR foi significativamente aumentada na estimulação de TLR3 na maior temperatura em comparação com os controles não estimulados, enquanto a regulação positiva foi significativamente prejudicada quando incubados em menor temperatura.  Da mesma forma, a regulação positiva dependente de TLR3 de ICAM-1 nas VEs também foi significativamente diminuída pela exposição ao frio. Sendo assim, as descobertas sugeriram que o acondicionamento aprimorado das proteínas receptoras de superfície LDLR e ICAM-1 dentro das VEs resultantes da ativação de TLR3 foi dependente da temperatura ambiente.

Considerando a descoberta de que as interações vírus-receptor das VEs estimuladas por TLR3 contribuíram para a atividade antiviral e impediram a entrada do vírus nas células hospedeiras, os pesquisadores também exploraram se essa contribuição poderia ser afetada pela redução da temperatura ambiente. As VEs estimuladas por TLR3 exibiram atividades antivirais significativamente aumentadas contra RV-1B e RV-16 quando produzidos a 37^oC em relação a 32^oC. Os resultados foram consistentes as descobertas dos autores, de que a temperatura ambiente fria prejudica a produção de proteínas receptoras de superfície dentro das vesículas induzidas pela estimulação TLR3 e leva a um empacotamento de carga menos eficiente nas VEs. Além disso, a redução significativa na atividade antiviral foi parcialmente eliminada ao silenciar o LDLR ou ICAM-1, sugerindo uma correlação robusta entre a atividade antiviral dependente da temperatura mediada nas VEs estimuladas por TLR3 e empacotamento de proteínas receptoras de superfície dentro das vesículas extracelulares.

Figura 1: Representação gráfica dos mecanismos envolvidos de como o frio prejudica a imunidade antiviral nasal. Figura adaptada de Huang e colaboradores (2022).

As descobertas não apenas lançam luz sobre o papel das VEs nas respostas imunes inatas antivirais dependentes de TLR3 no epitélio nasal humano, mas também contribuem para a compreensão fundamental do mecanismo da variação sazonal na prevalência da infecção.

Huang e colaboradores (2022) demonstraram que a ativação do TLR3 epitelial nasal por vírus respiratórios inalados leva ao aumento da secreção das VEs com uma abundância de componentes antivirais, incluindo miR-17, LDLR e ICAM-1. Esse processo exibe atividade antiviral potente e protege o hospedeiro contra infecções por meio da transferência de miRNAs antivirais e ligação direta de vírions suspensos em muco. Além disso, essas funções são prejudicadas pela exposição ao frio por meio de uma redução na secreção total das VEs e do empacotamento de mRNA, bem como da afinidade de ligação antiviral.