Se encuentran niveles elevados de prostaglandinas (PG), productos de las ciclooxigenasas (COX), en el plasma y en las heces de los niños infectados por rotavirus. Pretendemos determinar el papel de las COX, las PG y las vías de transducción de señal involucradas en la infección por rotavirus para elucidar los posibles nuevos objetivos de la terapia antiviral. Se infectaron células intestinales humanas Caco-2 con rotavirus humano Wa o rotavirus simiano SA-11. Se determinaron la expresión de ARNm de COX-2 y los niveles secretados de PGE22 en diferentes momentos posinfección y se estudió el efecto de los inhibidores COX sobre la infección por rotavirus por medio de un ensayo de inmunofluorescencia (IFA). Para revelar las vías de transducción de señal involucradas, se analizaron el efecto de MEK, la proteín cinasa A (PKA), la proteín cinasa p38 mitógeno-activada (MAPK) y los inhibidores de NF-κB sobre la infección por rotavirus. En las células Caco-2 infectadas, se detectó un incremento en la expresión del ARNm COX-2 y en los niveles secretados de PGE2. La indometacina (inhibiendo tanto COX-1 como COX-2) y los inhibidores específicos de COX-1 y COX-2 redujeron la infección por rotavirus en un 85 y 50%, respectivamente, medido con IFA. La indometacina redujo la infección por el virus en un paso posenlace temprano en el ciclo de la infección, inhibiendo la síntesis de proteína del virus. No parece que la indometacina afecte la síntesis viral de ARN. Los inhibidores de MEK, PKA, p38 MAPK y NF-κB disminuyeron la infección por rotavirus en por lo menos el 40%. PGE2 contrarrestó el efecto de los inhibidores COX y PKA pero no el de los inhibidores MEK, p38 MAPK y NF-κB. Concluyendo, COX y PGE2 son mediadores importantes de la infección por rotavirus en un paso posenlace. La vía ERK1/2 mediada por PKA está involucrada en la inducción de COX por la infección de rotavirus. Las vías MAPK y NF-κB están involucradas en la infección por rotavirus pero de una forma independiente de PGE. Este reporte ofrece nuevas perspectivas en la búsqueda de agentes terapéuticos en el tratamiento de la diarrea severa en niños generada por rotavirus.
Rotavirus-un miembro de la familia Reoviridae-es un virus no encapsulado, con ARN de doble-cadena. Es la causa única más importante de gastroenteritis viral severa y algunas veces fatal y de diarrea deshidratante en niños alrededor del mundo. Cada año, el rotavirus causa aproximadamente 111 millones de episodios de gastroenteritis que requieren solo cuidado ambulatorio, 25 millones de consultas médicas, 2 millones de hospitalizaciones y 352,000 a 592,000 muertes (mediana, 440,000 muertes) en niños menores de 5 años de edad. A la edad de 5 años casi todos los niños alrededor del mundo habrán tenido un episodio de gastroenteritis por rotavirus, 1 en 5 asistirán al médico, 1 en 65 serán hospitalizados y aproximadamente 1 en 293 morirán como resultado de la infección. Los niños en países no desarrollados corresponden al 82% de las muertes por rotavirus (referencia 44 y las referencias en ese artículo).
El rotavirus generalmente se replica en enterocitos maduros del intestino delgado, liderando la inducción de la expresión del gen del virus y una variedad de citocinas inflamatorias, reducción de la expresión del gen del enterocito y vacuolización (6, 8, 48). Recientemente, se ha reportado que el rotavirus puede entrar en el interior del cuerpo de los niños infectados, resultando en antigenemia y posiblemente viremia (5). Este hallazgo es importante para la comprensión de la patogénesis de la infección por rotavirus, la cual sólo se conoce en forma incompleta, a pesar de su prevalencia y estudios extensos en diferentes modelos animales.
Previamente, se han reportado niveles elevados de prostaglandinas (PG) PGE2 y PGF2 en el plasma y en las heces de los niños infectados con rotavirus (66), indicando que las ciclooxigenasas (COX) y las PG pueden estar involucradas en la patogénesis del rotavirus. Las COX son enzimas esenciales en la biosíntesis de PG. Ellas convierten el ácido araquidónico, liberado por los glicerofosfolípidos de membrana por la fosfolipasa A2, a PGH2. Los isómeros específicos luego transforman PGH2 a PG biológicamente activas tales como PGE2 y PGF2 (12, 22).
Dos genes distintos, COX-1 y COX-2, codifican dos COX respectivas. COX-1 es expresada constitutivamente en la mayoría de las células, incluyendo las células de las criptas intestinales. Recientemente, se han identificado nuevas variantes splice de COX-1 (PCOX1a, PCOX1b, y COX-3) y se encontró que se expresaban en una gran cantidad en el cerebro y el corazón (9). La expresión de COX-2 se puede inducir en una variedad de células tales como células epiteliales y macrófagos (15, 26, 31, 55). La expresión de COX-2 parece ser altamente regulada por varias de proteín cinasas mitógeno-activadas (MAPK) y los factores de trascripción, en especial, NF-κB (3, 17, 41, 49, 57). Además, la infección con muchos virus, incluyendo el virus herpes (29, 33, 34, 59, 67), virus pox (43), virus de la leucemia de las células -T humanas (37) y el virus de la leucemia bovina (BLV) (47), ha sido asociado con la modulación de la expresión de COX-2 y la producción de PG.
PG sirven como segundos mensajeros que producen un amplio rango de respuestas fisiológicas en células y tejidos. Especialmente, se conoce que las PG de la serie E tienen propiedades inmunomoduladoras. Además de mediar los síntomas inflamatorios, las PG pueden ejecutar efectos anti-inflamatorios. Por ejemplo, PGE2 inhibe la secreción del interferón gamma, una citocina que tiene actividad antiviral (23), y cambia la respuesta inmune hacia un perfil de citocina tipo-Th2 (interleucina-4 e interleucina-5), siendo menos efectiva en el desarrollo de una respuesta antiviral (4). Además, la PGE2 tiene un efecto estimulante en la replicación del virus, incluyendo el virus herpes (1, 29, 59, 60, 68) y BLV (47). En contraste, se sabe que PGE2 inhibe la replicación del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) en macrófagos (24) y está asociada con una pérdida sostenida de la replicación viral en pacientes con hepatitis B crónica (61).
Las principales PG, PGE1 y PGE2, pueden ser convertidas a PG ciclopentenonas (cyPG) PGA1 y PGA2, respectivamente (42). Se ha mostrado que cyPG tienen actividades biológicas diferentes a las de las PG primarias. CyPG inhiben la replicación de una variedad de virus, incluyendo tanto virus DNA como virus ARN (51). De forma interesante, la infección por rotavirus es inhibida por PGA1 (58).
Actualmente, no hay disponible ninguna vacuna efectiva contra el rotavirus. La vacuna tetravalente-rotavirus rhesus atenuada viva Rotashield, la primera vacuna contra el rotavirus con licencia, fue retirada del mercado mundial a finales de 1999 debido a un incremento en la incidencia de intususcepción (16, 39). Esto, junto con los diferentes niveles de eficacia asociados con el uso de algunos rotavirus atenuados vivos desarrollados para la administración oral (2, 28), apunta a la necesidad del desarrollo de estrategias alternativas para la prevención y/o tratamiento de la enfermedad diarreica por rotavirus. En este estudio, determinamos si la infección por rotavirus de las células Caco-2 influenciaba la expresión de ARNm COX-2 y la secreción de PGE2. Además, se estudió el efecto de los inhibidores COX Y PGE2 sobre la infección por rotavirus en las células Caco-2. También, se analizó el efecto de los inhibidores de las vías conocidas que median la regulación de la actividad COX sobre la infección por rotavirus de las células Caco-2. Los resultados mostraron claramente que COX y PGE2 son mediadores tempranos importantes de la infección por rotavirus y que la inhibición de la actividad COX o la síntesis de PG bloquean la infección por rotavirus en un paso posenlace, como fue medido por un ensayo de inmunofluorescencia (IFA). Estos hallazgos pueden llevar a una nueva estrategia de tratamiento para la enfermedad diarreica por rotavirus.
Materiales y Métodos
Células, medio de cultivo, virus y reactantes. Las células Caco-2 se mantuvieron en un medio de Eagle modificado de Dulbecco’s (DMEM; GibcoBRL, Paisly, Escocia) que contenía 10% (vol/vol) suero fetal de ternero (FCS; Integro, Dieren, Holanda), 100 U de penicilina/ml, 100 μg de estreptomicina/ml y 1% (vol/vol) de amino ácidos no esenciales (BioWhittaker, Verviers, Bélgica) a 37°C y 5% de CO2.
La cepa de rotavirus humano Wa, la cepa de rotavirus simiano SA-11 y el antisuero policlonal (K3ppIV) contra a cepa de rotavirus simiano SA-11 fueron proporcionados gentilmente por M. Koopmans (Bilthoven, Holanda). El suero fue preparado inoculando conejos con rotavirus SA-11 parcialmente purificado (usando ultracentrifugación) originado de células MA-104 infectadas. Se conoce que la inoculación usada contiene proteína NSP4; por lo tanto, este suero también reconoce la proteína NSP4. Además, el antisuero reacciona cruzadamente con la cepa de rotavirus humano Wa usada en este estudio. El anticuerpo monoclonal anti-β-tubulina y la indometacina, NS-398, KT-5720, PD09859, U0126, PGE2, ditiocarbamato de pirrolidina (PDTC) y SB203580 fueron comprados en Sigma- Aldrich (St. Louis, Mo.). Se obtuvo SC-560 de Calbiochem (San Diego, Calif.). Los posibles efectos citotóxicos de los inhibidores y sus solventes, fueron probados, usando el reactante de proliferación celular WST-1 y el kit de detección de citotóxidad de deshidrogenasa láctica (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) ensayos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todos los inhibidores se usaron a concentraciones que no tóxicas para las células.
Estudios de inhibición de la infección. Para probar el efecto de los diferentes inhibidores de vías de señales específicas sobre la infección del rotavirus, se colocaron 1.5 x 104 células Caco-2 en laminillas de microscopio cubiertas con teflón abundante (Cel-line/Erie Scientific, Portsmouth, N.H.) (7-mm diámetro) 1 día antes de iniciar el experimento. Las células sometidas a un proceso de lavado tres veces con medio de cultivo sin FCS (DMEM-FCS) e incubadas con diferentes concentraciones de los inhibidores por 1 hora a 37°C antes de la infección. Simultáneamente, el rotavirus fue activado por 1 hora a 37°C con 10 μg de tripsina/ml diluida en DMEM-FCS. Subsecuentemente, las células Caco-2 fueron inoculadas con 100 unidades formadoras de colonias (ufc) de rotavirus en presencia o ausencia de los inhibidores. A las 15 horas posinoculación (p.i.), las células fueron fijadas en methanol congelado a -20°C por 10 min y almacenados en solución salina con solución amortiguadora de fosfato (PBS). La infección fue monitoreada por un IFA indirecto. Para este propósito, las células fueron incubadas por 90 min a temperatura ambiente con el suero antirotavirus policlonal (K3ppIV) diluido en PBS (1:1,600), lavadas cuatro veces con PBS y marcadas por 60 min con inmunoglobulina de cabra (IgG) conjugada-Roja de Texas anti-conejo (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pa.) diluida en PBS (1:200). Finalmente, las células fueron sometidas a un proceso de lavado extensivo y montadas en solución Mowiol (25) que contenía 2.5% (wt/vol) DABCO (1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano) y 0.5 μg de DAPI (4’, 6-diamidino-2-fenilindola dihidrocloruro: hidrato; Sigma-Aldrich)/ml. Se vio la fluorescencia con un microscopio Nikon Eclipse E800. El número de células infectadas en las células tratadas y no tratadas con medicamento fue expresado como un porcentaje del número promedio de células infectadas en los cultivos de células no tratadas.
Aislamiento del ARN y RT-PCR. Se aisló el ARN total de las células Caco-2 modelo o infectadas con rotavirus en diferentes puntos de tiempo p.i. con un kit de aislamiento de ARN RNeasy de acuerdo con el protocolo del fabricante (QIAGEN, Hilden, Alemania). El ARN de cadena única (ARNss) y el ARN de doble-cadena (ARNds) fueron aislados usando el método descrito por Chen et al. (10). Se usaron primeres aleatorios y oligo (dT)15 (relación de 2:1) para sintetizar ADNc por el uso de la transcriptasa reversa del virus de leucemia murina Moloney de acuerdo con el protocolo del fabricante (Promega, Madison, Wis.). Para amplificar un fragmento 305-bp de COX-2, oligonucleótidos p338 (5’-TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT-3’), idéntico a los nucleótidos (nt) 574 a 596 (18), y p339 (5’-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT-3’), complemento reverso de nt 855 a 878 (18), y un protocolo de temperatura cíclica que consistía de 10 min de precalentamiento a 96°C seguido por 40 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 96°C, 1 min de proceso del templado del primer a 60°C, y 1 min de primer extensión a 72°C. El ADNc fue amplificado por PCR como se describió previamente (32).
La eficiencia de la PCR-transcriptasa reversa (RT-PCR) fue determinada amplificando 18S ARN por el uso del oligonucleótido 5’ 18S (5’-TCC TGC CAG TAG CAT ATG CTT G-3’) y del oligonucleótido 3’ 18S (5’-AGA GGA GCG AGC GAC CAA AGG-3’) o amplificando la β-actina humana por el uso del oligonucleótido p68 (5’-CAA GGC CAA CCG CGA GAA G-3’) y el oligonucleótido p69 (5’-CAG GGT ACA TGG TGG TGC C-3’), resultando en un producto de PCR 587-bp, como se describió previamente (62). El protocolo de temperatura cíclica para estos PCR consistió en 10 min de precalentamiento a 96°C, seguido por 30 ciclos de desnaturalización a 96°C, 1 min de proceso de templado a 60°C y 1 min de extensión del primer a 72°C. El ARN del rotavirus fue trascrito en reversa como se describió antes, con la excepción que se añadió 7% de (vol/vol) dimetil sulfóxido (DMSO) a la mezcla de reacción de la síntesis de ADNc. El ADNc de NSP4 del rotavirus Wa fue amplificado en la presencia de 7% de DMSO (vol/vol) por el uso del oligonucleótido p87 (GGA ACC ATG GAA AAG CTT ACC GAC CTC, idéntico a nt 46 a 62 [7] conteniendo un sitio NcoI) y el oligonucleótido p88 (TCC CCC GGG TCA CAT TAA GAC CGT TCC T, complemento reverso de nt 730 a 750 [7] conteniendo un sitio Smal). El protocolo de temperatura cíclica usado consistió en 10 min de precalentamiento a 96°C seguido de 25 ciclos de 1 min de desnaturalización a 96°C, 2 min de proceso de templado del primer a 53°C y 2 min de extensión del primer a 72°C.
Además, el ADNc VP4 del rotavirus Wa y SA-11 fue amplificado en la presencia de 7% (vol/vol) DMSO por el uso del oligonucleótido p90 (TAT ACC ATG GCT TCA CTC ATT TAT AGA C; idéntico a nt 7 a 28 [39] contendiendo un sitio Nco) y el oligonucleótido p91S (TTG AGG ATC CTA TGC CTT ATA TGA TAT TTC, complemento reverso de nt 883 a 900 [39] conteniendo un codón de finalización y un sitio BamHI). Para esta PCR, el protocolo de temperatura cíclica consistió en 10 min de precalentamiento a 96°C, seguidos por 25 ciclos de 1 min de desnaturalización a 96°C, 2 min de proceso de templado del primer a 51°C y 2 min de extensión del primer a 72°C. Los productos PCR fueron visualizados y cuantificados usando un sistema Gel Doc 2000 y el software de Multi-Análisis versión 1.1 (Laboratorios Bio-Rad, Inc., Hercules, California).
EIAs para PGE2. La cantidad de PGE2 secretada en los supernadantes de las células Caco-2 modelo- o infectadas por rotavirus (multiplicidad de la infección [MOI] = 1) fue determinada en los momentos indicados con un inmunoensayo de enzima competitiva (EIA; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) de acuerdo al protocolo del fabricante.
Análisis de Western blot. Las células Caco-2 eran modelo (no infectadas) o infectadas con rotavirus (MOI = 1). En los momentos indicados, las células fueron desintegradas en una solución amortiguadora de lisis (20 mM Tris, 1 mM EDTA y 0.75% [vol/vol] Triton X-100 conteniendo 0.1 mg de inhibidor de tripsina de soya/ml, 0.01 mg de pepstatina A/ml, 1% [vol/vol] aprotinina,
0.01 mg de leupeptina/ml y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonil) por tres ciclos de congelamiento y descongelamiento. Los restos celulares fueron aclarados por centrifugación a 10,000 X g por 5 min a 4°C. Las alícuotas de las muestras de proteína fueron separadas en un sulfato de sodio dodecil -15% gel poliacrilamida y transferidas dentro de membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) (0.1 µM) como se describió previamente (63). Subsecuentemente, las membranas fueron incubadas en una solución amortiguadora marcada (50 mM Tris-HCl [pH 7.8], 2 mM CaCl22 5% [wt/vol] leche en polvo, 0.01% [vol/vol] agente antiespuma, 0.05% [vol/vol] Triton X-100) por 1 h para bloquear el enlace no específico e incubadas con suero anti-rotavirus K3ppIV diluido en solución amortiguadora marcada (1:1,000) por 15 h a 4°C o con el anticuerpo monoclonal anti-β-tubulina diluido en solución amortiguadora marcada (1:400) por 1 h a temperatura ambiente. Las membranas fueron sometidas tres veces a un proceso de lavado con la solución amortiguadora marcada e incubadas por 1 h con IgG de cabra anti-conejo marcada con peroxidasa (1:2,000) diluida en solución amortiguadora marcada o con IgG de conejo anti-ratón marcada con peroxidasa (1:1,000) diluida en solución amortiguadora marcada. Las membranas fueron lavadas extensivamente con PBS antes de que las proteínas fueran visualizadas usando 0.05% (wt/vol) de diaminobenzidina en 50 mM mM Tris-HCl (pH 7.5) –0.013% (vol/vol) H2O2. Las marcas fueron escaneadas y analizadas usando un software de ImageQuant TL (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra).
Titulación del virus. Se determinó la infectividad viral en el medio de cultivo y las células 15 h p.i. por un ensayo cuantitativo sobre las células Caco-2. Las células Caco-2 que crecieron en 10 láminas de microscopio cubiertas con teflón abundante, fueron inoculadas con diluciones seriadas de muestras del medio combinado con los restos celulares aclarados de las células infectadas hechas en el medio de cultivo. Subsiguientemente, se determinó la cantidad de ufc usando un IFA indirecto como se describió arriba.
Análisis estadístico. Cada ensayo se llevó a cabo por lo menos dos veces y cada experimento se repitió por lo menos una vez. Los datos son presentados como promedios + errores estándar de los promedios. Para el análisis estadístico, se llevó a cabo un análisis de varianza de una-vía usando la prueba Tukey-Kramer y la versión 3.00 de Prism GraphPad para Windows (Software GraphPad, San Diego, California). En todas las pruebas, p<0.05 fue considerado estadísticamente significativa.
►Para descargar el artículo completo en formato PDF, haga click aquí