Para descargar el artículo completo en formato PDF con imágenes, haga click aquí
La tiazolida nitazoxanida [2-acetoliloxi-N-(5-nitro-2-tiazolil)benzamida] (NTZ) muestra un amplio espectro de actividades contra una amplia variedad helmintos intestinales y tisulares, protozoarios, y bacterias entéricas que afectan animales y humanos. Se ha postulado que el medicamento actúa a través de la reducción de su grupo nitro por las nitrorreductasas, incluyendo piruvato ferredoxín oxidorreductasa. En este estudio, investigamos las eficacias de nitazoxanida y varias tiazolidas contra los taquizoitos del Neospora caninum in vitro. Empleamos un monitoreo basado en PCR en tiempo real de la adhesión, invasión y proliferación intracelular del taquizoito, así como visualización por microscopía de electrones, de los efectos impuestos por nitazoxanida. Además, investigamos varias versiones modificadas de este medicamento. Estas modificaciones incluían por un lado el reemplazo del grupo nitro del anillo de tiazol con un bromuro, por lo tanto se removía el grupo más reactivo y por el otro lado, el posicionamiento diferencial de grupos metilo en el anillo de salicilato. Mostramos que el grupo nitro asociado a tiazol no se requiere necesariamente para la acción del medicamento y que la metilación del anillo de salicilato puede resultar en la abolición completa de la actividad antiparasitaria, dependiendo en la posición del grupo metilo. Estos hallazgos indican que otros mecanismos diferentes al modo propuesto de acción involucrando la enzima oxidorreductasa ferredoxín piruvato puede ser responsable de un amplio espectro de la actividad antiparasitaria de NTZ y que las modificaciones con el anillo de benceno pueden ser importantes en estos mecanismos alternos.
Neospora caninum es un parásito apicomplejo que representa uno de los agentes causales más importante de aborto infeccioso bovino, mortinatos y nacimiento de terneros débiles. Además el N. caninum causa enfermedad neuromuscular en perros y la infección con éste parásito se ha demostrado muchas más especies alrededor del mundo (7, 14). La importancia económica de la neosporosis, especialmente en el ganado ha llevado a inversiones considerables por parte de los cuerpos gubernamentales y farmacéuticos, con el objetivo de desarrollar estrategias para la prevención y tratamiento de la neosporosis. Los estudios epidemiológicos han mostrado que los perros y los coyotes actúan como huéspedes definitivos que albergan los ooquistes (6, 9, 21, 22). Recientemente, Gondim et al. (10) han demostrado de forma concluyente la transmisión transplacentaria y el aborto en vacas a las que se les administraban ooquistes de N. caninum.
Por lo tanto, varias investigaciones se han enfocado en la intervención terapéutica como los medios posibles de prevenir la neosporosis. Un amplio rango de compuestos, incluyendo lasalocid, monensina, piritrexim, pirimetamina, clindamicina, robenidina y trimetoprim, han mostrado antes actividad parasiticida contra los taquizoitos de N. caninum en los ensayos basados en cultivos celulares (18, 20). Más recientemente, se ha reportado que artemisina y depudecín muestran actividad antiparasitaria in vitro (16, 17), y Youn et al. (34, 35) demostraron la eficacia in vitro de extractos alcohólicos de hierbas contra los taquizoitos de N. caninum. Darius et al. (5) usaron la microscopía de electrones para describir los efectos in vitro de toltrazuril, una triazinona simétrica, y su derivado metabólico ponazuril contra los taquizoitos de N. caninum en el cultivo celular. Varios estudios emplearon el modelo murino. Se investigaron sulfadiazina y amprolium (19), y sulfadiazina administrada a 1 mg/ml previno la enfermedad en ratones infectados experimentalmente pero no eliminó el parásito. Varios estudios con ratones enfocados en toltrazuril (1, 11, 12), mostraron que la inclusión de toltrazuril en el agua para beber abolía la detección del parásito en el sistema nervioso central pero que la inmunidad mediada por células era necesaria para alcanzar la eficacia completa en los ratones. Con respecto al huésped natural, los perros y el ganado, los intentos de tratar la neosporosis se han mantenido en sus estadios iniciales y hasta el momento no se han elaborado estrategias para el tratamiento eficiente.
En este estudio, investigamos la eficacia in vitro de nitazoxanida (NTZ) [2-acetoliloxi-N-(5-nitro-2-tiazolil) benzamida] (29) contra los taquizoitos de N. caninum. NTZ es conocida porque muestra un amplio espectro de actividad contra una amplia variedad de parásitos intestinales y bacteria entéricas que afectan animales y humanos (8, 33). La amplia aplicabilidad de éste medicamento también incluye el tratamiento de pacientes humanos que sufren de diarrea causada por infección con el apicomplejo Cryptosporidium parvum, así como el tratamiento de la mieloencefalitis equina causada por Sarcocystis neurona, para la cual está droga ha obtenido la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA). Se ha postulado que NTZ tiene un modelo de acción basado sobre la reducción de su grupo nitro por las nitrorreductasas, incluyendo la piruvato ferredoxín óxido-reductasa (PFOR), pero en contraste con el metronidazol (MTZ), se ha mostrado como no mutagénico (31). Empleamos un monitoreo basado en PCR en tiempo real de la adhesión del taquizoito, invasión y proliferación intracelular, así como visualización por microscopía de electrones de los efectos impuestos por NTZ. Además, investigamos los efectos de varias versiones modificadas de este medicamento. Nuestros hallazgos indican que otros mecanismos, aparte del modelo propuesto de acción que involucra PFOR, podrían ser responsables del amplio espectro de NTZ, con el anillo de benceno siendo una parte importante para alcanzar la actividad antiparasitaria.
Materiales y métodos
Medio de cultivo tisular, bioquímicos y medicamentos. Si no se afirma de otra manera, todos los medios de cultivos tisulares fueron comprados en Gibco-BRL (Zurich, Suiza), y los agentes bioquímicos eran de Sigma (St. Louis, MO). NTZ, tizoxanida, tizoxanida glucurónido y los derivados de NTZ (Rm4803, Rm4820, Rm4821, Rm4822) (Fig. 1) fueron sintetizados en el Departamento de Química de la Universidad de Liverpool. Estos se mantuvieron como soluciones de inventario a 10 mg/ml en dimetilsulfóxido y fueron almacenadas a -20°C.
Cultivo tisular y purificación parasitaria. Los cultivos de células Vero se mantuvieron en un medio RPMI (Gibco-BRL, Basel, Suiza) suplementado con 5% de suero fetal de ternero (FCS), 2 mM de glutamina, 50 U de penicilina/ml, y 50µg de estreptomicina/ml a 37°C con 5% CO2 en los frascos de cultivo tisular. Los cultivos fueron tripsinizados por lo menos una vez por semana. Los fibroblastos de prepucio humano (HFF) se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco-BRL) conteniendo los mismos aditivos y fueron tratados en forma idéntica. Los taquizoitos de N. caninum (aislados Nc-1 y Nc-Liverpool) se mantuvieron en los cultivos de monocapas de célula Vero (13), durante ese momento FCS fue reemplazado con inmunoglobulina G libre de suero de caballo. Los parásitos fueron recogidos cuando estaban todavía intracelulares por tripsinización de las celular Vero infectadas, el paso repetido a través de una aguja de calibre 25 a 4°C y la separación en columnas G25 de Sefadex como se describió previamente (13).
Infección de HFF y los ensayos in vitro de tratamiento con medicamento. Los ensayos in vitro del medicamento se llevaron a cabo para evaluar los efectos del medicamento sobre la proliferación de taquizoitos de N. caninum. HFF crecieron en monocapas confluentes en placas de cultivo tisular de 24 orificios (Sarstedt, Newton, MA). Los taquizoitos purificados de N. caninum (5 X104) fueron suspendidos en 1 ml de DMEM que contenía el 5% de suero fetal de ternero, 50 U de penicilina/ml, y 50 µg de estreptomicina/ml y fueron añadidos a las monocapas y se dejaron por 2 h a 37°C con CO2 al 5%. Subsecuentemente, los parásitos no unidos fueron removidos por un proceso de lavado en DMEM, y las monocapas infectadas se mantuvieron en DMEM-FCS-penicilina-estreptomicina que contenía el medicamento como se ha indicado para los experimentos individuales. Los controles contenían las cantidades apropiadas de DMSO solo. Con el fin de evaluar la toxicidad selectiva, las monocapas de fibroblastos no infectados fueron tratadas de forma idéntica. Los cultivos se mantuvieron a 37ºC con CO2 al 5% por varios períodos de tiempo como se indica más abajo, con cambios en el medio cada 2 días y fueron inspeccionados por microscopía de luz diariamente. En algunos experimentos, NTZ fue añadida antes de la infección de las células huésped. Las muestras para monitorear la proliferación del parásito se tomaron en diferentes puntos de tiempo luego de la iniciación del tratamiento con el medicamento. Para esto, el medio fue removido, y se tomó el material celular en 180 µl de solución amortiguadora (buffer) de lisis, 20 µl de proteinasa K (kit de DNAeasy; QIAGEN), Y 200 µl de solución salina en solución amortiguadora de fosfato. Los especimenes fueron transferidos a tubos Eppendorf y fueron congelados a -20º C antes de la extracción de ADN. Cada ensayo en un experimento dado se llevo a cabo cuatro veces, y se mostró el desenlace de un experimento representativo de por lo menos tres experimentos independientes, todos produciendo virtualmente resultados idénticos.
Ensayo de adhesión/invasión basado en PDTC. Los ensayos de adhesión/invasión se hicieron con el fin de evaluar los efectos del medicamento sobre la adhesión y la invasión del parásito a la célula huésped. Los ensayos se llevaron a cabo esencialmente como se describió antes (26). De una forma sucinta, las monocapas de HFF crecieron en placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 orificios (Sarstedt). Los taquizoitos N. caninun (5 _ 104) fueron resuspendidos en 100 µl de DMEM que contenía suero de caballo al 5% y fueron incubados en NTZ (10 µg/ml) por 2 h, 6 h, o 24 h y añadidos a las monocapas. Se les permitió invadir por 30 min a 37º C con CO2 al 5%. Los parásitos no unidos fueron removidos por un proceso de lavado en DMEM, y las monocapas infectadas fueron incubadas con DMEM que contenían 100 µM de pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), 0.2 µM de CuSO4, y un suero hiperinmune policlonal de conejo contra el taquizoito entero de N. caninum (1:200) (13) por 2 h a 37º C. Se llevaron a cabo, en paralelo, las incubaciones de control en DMEM. Subsecuentemente, las placas fueron lavadas una vez con DMEM, y se añadió el DMEM que contenía 1 mg/ml de DNAsa I. Las preparaciones fueron incubadas por 1 h a 37º C. Las placas de control también fueron lavadas e incubadas con DMEM solo. Finalmente, todas las placas fueron lavadas con un medio que contenía 1mM de EDTA para inhibir la actividad de DNAsa I, y el material celular se tomó en 180 µl de solución amortiguadora de lisis (kit de DNAeasy; QIAGEN). Los especimenes fueron transferidos a tubos de Eppendorf, calentados por 5 min a 95º C, y almacenados a -20º C antes del uso adicional. Los ensayos se llevaron a cabo cuatro veces y los experimentos se repitieron tres veces, produciendo esencialmente resultados idénticos. Se muestran los resultados de un experimento representativo.
El procesamiento de las muestras de ADN y la PCR cuantitativa basada en LightCycler. La purificación de ADN se llevó a cabo usando el kit de DNAeasy (QIAGEN, Basel, Suiza) de acuerdo con el protocolo estándar adecuado para las muestras de tejido. El ADN fue diluido en 100 µl de buffer EA (dilución buffer del kit) y luego hervido por 5 min. Para la PCR cuantitativa, se usaron el primer de avance Np21plus y el primer de reversa Np6plus. Estos primer habían sido diseñados para amplificar una secuencia de 337 –bp de la región Nc5 del N. caninum (25). La detección de los productos de amplificación de ADN y la cuantificación del número de parásitos a través de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia en el instrumento LightCycler (Roche Diagnostics, Basel, Suiza) se hicieron como se describió previamente (26), evaluando los valores promedio (más desviaciones estándar) de las determinaciones triplicadas. Como estándares externos, se incluyeron las muestras que contenían equivalentes de ADN de 100, 10, y 1 taquizoito de N. caninum. La reproductividad del sistema de pruebas se demostró probando una baja variación global dentro de los tres procesos independientes de las reacciones estándar y los resultados de PCR fueron validados sólo cuando la diferencia en los valores máximos derivados secundarios dentro de los triplicados no se extendieron por un ciclo.
Análisis estadístico. Para los experimentos en el curso de tiempo, se determinó la significancia de las diferencias entre los valores de los puntos finales de los ensayos control y experimentales por una prueba t de Student, usando el programa Microsoft Excel. Los valores de P <0.05 fueron considerados estadísticamente significativos. Lo mismo fue válido para los ensayos de adhesión/invasión basados en PDTC.
Microscopía de transmisión de electrones. Las monocapas de HFF crecieron en seis placas de cultivo tisular, infectados con taquizoitos N. caninum y tratados con NTZ (10 µg/ml) como se describió antes. En diferentes puntos de tiempo, las monocapas fueron sometidas a un proceso de lavado breve en 100 mM de solución amortiguadora de cacodilato de sodio, pH 7.2, y se fijaron en 100 mM de buffer de cacodilato de sodio que contenía glutaraldehido al 2.5%. Las células fueron removidas usando una espátula de caucho y fueron centrifugadas a 100 X g a 4º C por 10 min. El aglomerado resultante fue fijado adicionalmente por 2 h a temperatura ambiente, seguida por post-fijación en OsO4 al 1% por 4 h a 4ºC. Subsiguientemente, los especimenes fueron sometidos a un proceso de lavado en agua y fueron premarcados en acetato de uranilo al 1% en agua por 1 h a 4ºC, seguidos por un lavado con abundante agua. Luego los especimenes fueron deshidratados en una serie graduada de soluciones de etanol y fueron incrustados en resina de Epon 820. La resina fue polimerizada a 65º C por un período de 48 h. Las secciones ultradelgadas se cortaron en un ultramicrótomo de Reichert y Jung y fueron cargadas en rejillas de malla de cobre 300 (Plano GmbH). El marcado con acetato de uranilo y citrato de plomo se llevó a cabo como se describió antes. Finalmente, las rejillas fueron observadas en un microscopio de transmisión de electrones Phillips 300 que operaba a 60 kV.
Resultados:
NTZ inhibe la proliferación intracelular de taquizoitos N. caninum. Con el fin de evaluar si NTZ inhibe la proliferación de los taquizoitos de N. caninum, se le permitió a los parásitos infectar monocapas de HFF por 1 h, y subsecuentemente se inició el tratamiento con el medicamento (NTZ a 1, 5, y 10 µg/ml). Se monitoreó la proliferación del parásito por PCR en tiempo real en diferentes puntos de tiempo hasta el día 8 post-infección (p.i.) (Fig. 2). Mientras que 1 µg/ml no mostró ningún efecto, 5 y 10 µg/ml mostraron ser muy efectivos en términos de inhibición de la proliferación de taquizoitos. La tizoxanida, un metabolito diacetilado (Fig. 1), mostró propiedades idénticas a aquellas de NTZ, mientras que la tizoxanida glucurónido fue inefectiva (no se muestran los datos). En paralelo, la inspección en el microscopio de luz de las monocapas HFF infectadas y no infectadas no reveló ninguna alteración inducida por el medicamento, demostrando la toxicidad selectiva de NTZ (no se muestran los datos). Por lo tanto, se llevaron a cabo experimentos adicionales a 10 µg/ml de concentración del medicamento.
La actividad antiparasitaria de NTZ contra los taquizoitos de N. caninum está basada en diferentes dominios del medicamento. Ya que la eficacia parasiticida de NTZ sobre los taquizoitos de N. caninum fue evidente, se investigaron un serie de derivados de NTZ con el fin de elucidar qué dominios del medicamento actuarían sobre los taquizoitos de N. caninum. Se ha postulado que la actividad antiparasitaria de NTZ se basa en la reducción del grupo nitro en el anillo de tiazol de PFOR y otras nitrorreductasas (31). Un derivado NTZ, Rm4820 (Fig. 1), difiere de NTZ por el reemplazo del grupo nitro asociado al tiazol con un bromuro. Encontramos que Rm4820 fue igualmente efectivo contra los taquizoitos de N. caninum como NTZ en términos de inhibición de la proliferación y la actividad parasiticida (Fig. 3). En contraste, Rm4803, que es virtualmente idéntico a Rm4820 pero con un grupo metilo en la posición 3 del anillo de salicilato (Fig. 1), no mostró ninguna eficacia. Además, Rm4821 (metilado en la posición 5) y Rm4822 (metilado en la posición 4) fueron todos efectivos como NTZ y Rm4820 (Fig. 3). Estos hallazgos indican que el grupo nitro asociado al anillo de tiazol no representa el único domino activo de la molécula y que otro dominio, probablemente altamente relevante está localizado en la posición 3 del anillo de salicilato.
La microscopía de electrones revela efectos estructurales de NTZ en las monocapas HFF infectadas con N. caninum. Los efectos de NTZ en las monocapas infectadas fueron estudiados comparándolos con los cultivos no tratados por medio de microscopía de transmisión de electrones en diferentes puntos de tiempo p.i. En los cultivos de control (Fig. 4A), los taquizoitos de N. caninum se encontraron dentro de las células huésped y se localizaron dentro de la vacuola parasitófora, que está claramente separada del citoplasma de la célula huésped por la membrana de la vacuola parasitósfora (PVM), creando un compartimiento que le permite a los taquizoitos proliferar (Fig. 4B). En los cultivos tratados con NTZ fijados a 6 h p.i., los taquizoitos intracelulares también estaban presentes, pero no estaban presentes la vacuola parasitósfora claramente delineada ni su membrana correspondiente (Fig. 5A). Aunque los taquizoitos se encontraban libes dentro del citoplasma de la célula huésped, las células no mostraban signos de distorsión. La PVM que normalmente rodea el parásito completamente, estaba ausente. Esto se volvió más evidente después de 24 h (Fig. 5B). Los parásitos fueron localizados libremente en el interior de la célula huésped, pero ahora, el citoplasma de la célula huésped alrededor estaba distorsionado o degradado de una forma severa. Se observaron frecuentemente las gotas de lípidos en la vecindad de los taquizoitos. Los taquizoitos por sí mismos empezaron a mostrar alteraciones extensas, con numerosas vacuolas dentro del citoplasma del parásito, que parecían vacías o llenas con un material granular fino. Sin embargo, roptries y micronemas, dos organelos secretores característicos, así como la mitocondria, parecían estructuralmente normales. Después de 3 y 4 días de tratamiento (Fig. 5C y D, respectivamente), los taquizoitos mostraron alteraciones adicionales. Éstas incluían la presencia de un citoplasma altamente vacuolizado, con vacuolas de diferentes tamaño y contenido variable, llenas con material granular fino, pero también con algunos residuos membranosos electro-densos. La mitocondria parecía estar fragmentada y en la mayoría de los parásitos los organelos característicos, roptries y micronemas, no eran discernibles. Los taquizoitos estaban ampliamente rodeados por detritos citoplasmáticos de las células huésped y gotas de lípidos.
Caracterización de la actividad antiparasitaria de NTZ. Para identificar la cantidad mínima de tiempo requerido para que el medicamento actuara permanentemente sobre el parásito con el fin de ejecutar una toxicidad selectiva, se trataron las monocapas infectadas con NTZ en diferentes lapsos de tiempo, seguido por un cultivo adicional sin el medicamento por varios días (Fig. 6). Encontramos que HFF infectado con Neospora necesitaba estar en contacto con NTZ por 5 días consecutivos para que se mantuviera el efecto inhibitorio de la proliferación. Una incubación adicional de monocapas infectadas y tratadas con NTZ en la ausencia del medicamento hasta por 20 días no dio como resultado el recrecimiento de parásitos, mostrando que el tratamiento in vitro de HFF infectados, por período de 5 días consecutivos ejecutaba una actividad parasiticida (no se muestran los datos).
Luego investigamos si NTZ sería efectivo o no, si el tratamiento farmacológico era iniciado en etapas tardías de la infección, cuando ya se habían formado grandes seudoquistes que contenían numerosos taquizoitos. Encontramos que NTZ mostraba un efecto inhibitorio masivo también sobre la etapa tardía de infección, como en el día 3 o el día 4 p.i. (Fig. 7). Este efecto inhibitorio fue evidente rápidamente luego de la iniciación del tratamiento.
Se llevaron a cabo experimentos adicionales con el fin de investigar si NTZ podía afectar la entrada de la célula huésped por los taquizoitos de N. caninum (Fig. 8). Por esto, los taquizoitos purificados fueron resuspendidos en el medio que contenía NTZ, y el medicamento permaneció presente durante la fase de infección de 2 h. Subsecuentemente, las monocapas infectadas fueron cultivadas en presencia y ausencia de NTZ. Encontramos que la presencia de NTZ durante la infección y el mantenimiento subsecuente de los cultivos en la ausencia de NTZ, resultó en una curva de crecimiento idéntica a la de el control de infección no tratado (Fig. 8A). Esto indica que el medicamento no afectó notablemente el proceso de entrada a la célula huésped. Sin embargo, la presencia de NTZ durante la infección, y el tratamiento continuo subsiguiente in vitro por un período de 5 días, fue ligeramente más efectivo que el procedimiento sin pretratamiento (Fig.8A), pero los valores obtenidos no fueron estadísticamente significativos. Por lo tanto investigamos de forma adicional si un tratamiento más prolongado de los taquizoitos N. caninum afectaría su capacidad de interactuar con las monocapas HFF (Fig. 8B). Para esto, los taquizoitos extracelulares fueron resuspendidos en medio que contenía NTZ por diferentes lapsos de tiempo (2,6, y 24 h) y sólo después fueron añadidos a las monocapas de HFF. El número global de taquizoitos interactuando con HFF y el número de parásitos invasores se determinó con respecto a los controles incubados en el medio solo. Encontramos que durante un período de 24 h, NTZ no mostró un impacto negativo sobre los taquizoitos extracelulares con respecto a sus capacidades adhesivas o invasoras (Fig. 8B), indicando que el medicamento actúa en los parásitos en proliferación intracelulares pero no afecta el potencial invasor de los taquizoitos de N. caninum extracelulares.
Discusión
En Estado Unidos, NTZ (Alinia) es actualmente usado para el tratamiento de diarrea persistente causada por Cryptosporidium parvum y Giardia intestinalis en adultos, adolescentes y niños desde el primer año de edad. Además, el medicamento es comercializado para el tratamiento de la encefalitis equina causada por Sarcocystis neurona (Navigator). Ya que tanto el Cryptosporidium como el Sarcocystis pertenecen al Apicomplejo filum, investigamos la eficacia de este medicamento contra otro parásito apicomplejo, N. caninum.
Nuestros resultados presentados en este estudio indican que el tratamiento con NTZ inhibe la proliferación de N. caninum y daña severamente a los taquizoitos pero hay claras indicaciones de que la célula huésped, por lo menos en alguna extensión, también está involucrada en estos procesos. Primero, NTZ no actúa sobre los mecanismos involucrados en la invasión de la célula huésped, pero actúa sobre los mecanismos que afectan la proliferación del parásito. Segundo, era necesario un tratamiento por 5 días completos para ejecutar una actividad parasiticida verdadera. Durante los primeros 4 días del tratamiento in vitro, el daño impuesto sobre estos parásitos debía ser considerado parasitostático, permitiendo por lo menos que algunos taquizoitos retomaran su proliferación dentro de las primeras horas luego de la remoción del medicamento. El hecho de que 5 días de tratamiento continúo fuera necesario para alcanzar un efecto antiparasitario claramente indica que NTZ no ejecuta una eficacia tóxica inmediata pero que la toxicidad podría ser, por lo menos parcialmente, relacionado con los efectos mediados por la célula huésped.
Observamos que las células infectadas tratadas con NTZ están caracterizadas por la ausencia de una vacuola parasitófora y/o membrana de la vacuola parasitófora, la cual normalmente separa los taquizoitos de la membrana de la célula huésped. Se ha mostrado que los taquizoitos N. caninum, una vez que están dentro de la célula huésped, secretan un amplio rango de moléculas, con el objetivo de modificar la vacuola parasitófora y su membrana de acuerdo a sus propias necesidades; por lo tanto, este compartimiento es esencial para la sobrevida, desarrollo, y proliferación (7). Actualmente no sabemos si el parásito localizado en el citoplasma de la célula huésped sin una membrana vacuolar parasitófora a su alrededor también realiza eventos similares de secreción, pero encontramos que el citoplasma de la célula huésped en las células infectadas y tratadas con el medicamento estaba severamente alterado y mostraba un daño considerable. Se destaca que esto no fue observado en las células huésped no infectadas, indicando que las alteraciones en las células huésped estaban mediadas por el parásito o sus productos secundarios más que por el medicamento por sí mismo. Finalmente, a 72 y 96 h luego de la iniciación del tratamiento con NTZ, los taquizoitos intracelulares de N. caninum están caracterizados por la vacuolización incrementada del citoplasma parasitario, la fragmentación del mitocondrión único del taquizoito, y la acumulación de gotas de lípidos en la vecindad del parásito. Estos son todos signos de una actividad metabólica alterada de forma severa que puede ser atribuida a la acción del medicamento.
Es tentador especular que las células huésped infectadas y tratadas con el medicamento puedan sufrir apoptosis, mientras que las células no infectadas no. Es bien conocido que los parásitos intracelulares, incluyendo el Toxoplasma gondii y N. caninum, son capaces de modular el estado de sobrevida de sus células huésped (revisar en la referencia 15). Esto puede ocurrir a través de varias vías diferentes. Por ejemplo, Sinai et al. (30) encontró que los taquizoitos de T. gondii inhibían la apoptosis de la célula huésped induciendo la activación del factor de trascripción NF-κB, que a su vez regula la expresión de los inhibidores de apoptosis en la célula huésped. La activación de la vía NF-κB por el T. gondii se correlacionada con la localización del IκBα fosforilado en la membrana de la vacuola parasitófora (23). La falta de ésta membrana podría tener consecuencias potencialmente serias para la célula huésped en sí misma, ya que Molestina y Sinai (24) detectaron una actividad cinasa en la vacuola parasitófora de T. gondii que era capaz de la fosforilación de la IκBα huésped, demostrando una relación directa entre la presencia de esta membrana y la inhibición de la apoptosis de la célula huésped. Aunque hay solo información limitada disponible hasta la fecha (27,28), es muy probable que se presenten mecanismos similares en las células infectadas con N. caninum. Sin embargo, se necesitan investigaciones adicionales y más detalladas con el fin de definir el mecanismo de la actividad antiparasitaria de NTZ contra los taquizoitos de N. caninum, también tomando en consideración los efectos posibles mediados por la célula huésped.
El conocimiento actual sugiere que la actividad de NTZ es dependiente de la reducción intracelular de su grupo nitro por las nitrorreductasas en una forma similar a la de MTZ (31). Sin embargo, los mismos autores (31) también notaron diferencias entre MTZ y NTZ. Por ejemplo, el análisis de la mutación de la resistencia a rifampin en el Helicobacter pylori indica que NTZ no era mutagénico y no inducía la ruptura del ADN, a diferencia de MTZ, que causó daño del ADN y era fuertemente mutagénico. Nuestros experimentos, empleando varios derivados de NTZ definidos, algunos de los cuales no tenían el grupo nitro asociado al tiazol y algunos que contenían versiones modificadas de la fracción de ácido salicílico, demostraron la importancia del anillo de benceno localizado en el extremo opuesto de la molécula. Primero, el intercambio del grupo nitro por un bromuro no altera notablemente la actividad parasiticida de la molécula. Esto no implica que el grupo nitro no sea útil en términos de la actividad parasiticida, pero claramente sugiere que hay uno o más sitios activos adicionales que ejecutan un efecto antiparasitario. Uno de estos sitios podría ser la fracción de ácido salicílico. Encontramos que la actividad parasiticida de la molécula se pierde completamente si el anillo de ácido salicílico es metilado en la posición 3, mientras que la metilación en la posición 4 o 5 no tiene ningún efecto. Esto implica que la posición orto no modificada es esencial para la actividad parasiticida. Se necesitan investigaciones adicionales para determinar si las alteraciones ultraestructurales inducidas por estos derivados NTZ modificados corresponden a lo que hemos observado con NTZ.
Se necesitan estudios adicionales para investigar si NTZ será útil para el tratamiento in vivo de las infecciones por N. caninum. Una vez que se aplica de forma oral, NTZ es rápidamente diacetilado a tizoxanida, la cual muestra una actividad antiparasitaria igual in vitro. El segundo metabolito, tizoxanida glucurónido, no muestra actividad antiparasitaria in vitro contra los taquizoitos de N. caninum. Se ha usado el modelo murino de forma extensa para los estudios de patología e inmunología de la neosporosis experimental (1, 3, 4, 11, 12). Sin embargo, un análisis comparativo de la farmacocinética de los metabolitos de NTZ en ratones (32) y humanos (2) ha mostrado que la tizoxanida en los ratones alcanza sólo niveles muy bajos en suero (por debajo de 1 µg/ml por menos de 1 h), mientras que el pico de los niveles séricos de la tizoxanida en humanos alcanza 8 µg/ml y se mantiene sobre 4 µg/ml por un lapso de tiempo de 5 a 6 h. Por lo tanto, el modelo murino es esencialmente un modelo inadecuado para investigar la eficacia de este medicamento contra la infección con taquizoitos de N. caninum. Por lo tanto, sería importante obtener información detallada sobre la farmacocinética de este medicamento en el ganado o en los perros antes de embarcarse en cualquier experimento animal adicional para estudiar la eficacia in vivo de NTZ o sus derivados contra la neosporosis.