Se conoce relativamente poco acerca de la vida de este excepcional anatomista. Nació en San Severino, probablemente en el distrito de Ancona, aunque hay autores que sostienen que nació en Calabria. Se atribuyen diferentes años de nacimiento, siendo el más probable el 1513.
Hijo de Mariano Eustachi, un reconocido médico proveniente de familia noble, y de Francesca Benvenuti. Recibió una educación humanística de muy buen nivel, adquiriendo un excelente conocimiento del griego, el hebreo y el árabe que le permitió incluso realizar importantes traducciones.
Aparentemente estudió medicina en Archiginnsio della Sapenza en Roma, pero no se conoce precisamente cuando. Comenzó su práctica profesional en su tierra nativa aproximadamente en 1540.
Los talentos de Eustaquio eran tan notorios, que el duque de Urbino solicitó sus servicios como médico personal. Sirvió finalmente como médico al hermano del duque, el Cardenal Giulio della Rovere con quien se trasladó a Roma. Posteriormente, también serviría al Cardenal Peretti, quien luego sería el Papa Sixtus V. En Roma fue nombrado profesor de anatomía la la facultad de medicina de Collegia della Sapienza y su posición académica le permitió obtener cadáveres para disección. Con el correr de los años, se vio tan severamente afectado por la gota que tuvo que renunciar a su puesto.
A los supuestos 400 años de su nacimiento, en 1913, se erigió un memorial en su honor en el Sapienza de Roma. Junto con Veslius y Columbus, conforma el trío responsable de la anatomía moderna. Al decir de Morgagni y Haller, no quedó parte del cuerpo en la que Eustaquio no arrojara luz acerca de su estructura.
Sus primeros trabajos escritos fueron Ossium exam y De motu capitis, de 1561. En 1562 y 1563 produjo una remarcable serie de tratados acerca del riñón, el oído, el sistema venoso y los dientes. Estos fueron publicados en Opuscula anatomica (1564). Una de sus más reconocidas descripciones es la del canal que comunica el oído con la rinofaringe que lleva desde entonces su nombre. Incluso, existe la teoría que este descubrimiento de Eustaquio inspiró luego a Shakespeare a la hora de escribir Hamlet, cuyo padre fue asesinado instilándole veneno en un oído.
Las contribuciones de Eustaquio a la anatomía sufrieron una serie de vicisitudes que hicieron que su mérito real fuera reconocido muchos años después de su muerte. Sus investigaciones fueron plasmadas en ilustraciones en una serie de 47 placas con la colaboración del artista Pier Matteo Pini. Las primeras 8 fueron usadas en Opuscula anatomica. Las 39 restantes estuvieron perdidas luego de su muerte, intensamente buscadas por Marcello Malpighi entre otros. Luego de 162 años fueron encontradas en manos de un descendiente de Pini. Compradas por el Papa Clemente XI, se las entregó a Giovanni Maria Lancisi quien fue un sucesor de Eustaquio como profesor de anatomía de Sapienza. Este realizó una publicación con las 47 placas en 1714 con el título de “Ilustraciones Anatómicas de Bartholomeo Eustachi rescatadas de la oscuridad”, con lo que se terminó de consolidar el destacado sitial de Eustaquio en la historia de la anatomía.