Detección de endotoxinas salivales mediante un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral combinado mono/policlonal basado en anticuerpos
Se informa sobre un ensayo de flujo lateral (LFA) en el lugar de atención/uso para la detección de endotoxina de P. gingivalis, un importante biomarcador de saliva para la salud bucal. Se han evaluado dos enfoques diferentes de diseño de LFA en sándwich que utilizan la combinación de anticuerpos mono y policlonales o solo anticuerpo policlonal para detectar endotoxinas de P. gingivalis, con un límite de detección de ~22 ng mL -1 y 46,5 ng mL -1 para muestras a base de agua y saliva, respectivamente. El LFA también muestra buena selectividad a la endotoxina de P. gingivalis versus otras endotoxinas y proteínas. El pre-tratamiento de la saliva que combina filtración con jeringa y almidón de patata inhibe con éxito la actividad de la α-amilasa y proporciona mejores resultados en los dispositivos LFA. |
Introducción
Los fluidos biológicos, como la sangre, la orina, la saliva y la mucosidad, son quizás la fuente de información más importante sobre nuestro estado médico. Históricamente, y sigue siendo así hoy en día, el análisis de sangre es la herramienta de diagnóstico más común. La detección convencional de marcadores moleculares encontrados en muestras de biofluidos se lleva a cabo principalmente utilizando el conocido método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que requiere personal capacitado y un período de tiempo relativamente más largo en un laboratorio. Sin embargo, con el uso cada vez mayor de diagnósticos en el lugar de atención (POC), otros biofluidos están ganando importancia. El análisis rápido y de bajo costo de los biomarcadores presentes en diversos biofluidos puede proporcionar una indicación temprana de diversas afecciones médicas, mejorando así los resultados del tratamiento y reduciendo los costos médicos.
Como se demostró durante la pandemia de la enfermedad por coronavirus (COVID), el ensayo de flujo lateral (LFA) es una plataforma POC versátil con muchos beneficios, como tiempo de análisis rápido, bajo costo, interfaz colorimétrica fácil de usar, proceso de fabricación simple y sin necesidad de control externo. Debido a que los kits de pruebas caseras de COVID LFA se utilizaron ampliamente durante la pandemia, ahora existe una familiaridad mundial con los kits de pruebas de ensayo de flujo lateral (LFA). Además, se ha desarrollado el uso de teléfonos inteligentes para aplicaciones LFA no solo para mejorar el análisis de los resultados de las pruebas sino también para mejorar la sensibilidad del LFA.
Las endotoxinas inducen una fuerte respuesta inmune en los huéspedes, pero también sirven como importantes biomarcadores útiles para diagnosticar diversas enfermedades bacterianas. Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), una de las más de 700 especies bacterianas que se encuentran en la cavidad bucal y una de las 500 especies presentes en la placa subgingival, es una importante bacteria patógena gramnegativa responsable de la periodontitis crónica. La enfermedad periodontal presenta una inflamación crónica causada por una infección bacteriana, provocando enfermedades de las encías e incluso la pérdida de los dientes.
La presencia salival de esta bacteria en alta concentración sugiere que el paciente tiene una enfermedad de periodontitis crónica. Además, debido a la estrecha relación entre P. gingivalis y otras enfermedades sistémicas importantes, como las cardiovasculares, la artritis reumatoide y las enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer) como ha surgido en los últimos años, la evaluación cuantitativa del PG LPS se ha convertido en una medida clave en la salud bucal, así como en todo el sistema de salud corporal.
Comentarios
Ingenieros de la Universidad de Cincinnati han desarrollado un nuevo dispositivo que puede advertir a los consumidores sobre los riesgos tempranos de caries debido a enfermedades como la gingivitis y la periodontitis.
La gingivitis, la forma más temprana de enfermedad de las encías, es causada por bacterias. Pero no una bacteria cualquiera. El problema para los investigadores era conseguir un dispositivo para identificar el tipo particular responsable de la enfermedad, dijo Andrew Steckl, un eminente académico de Ohio y distinguido profesor de investigación en la Facultad de Ingeniería y Ciencias Aplicadas de la UC.
"Ha sido todo un desafío llegar al punto en que podamos detectar esta toxina creada por la bacteria responsable de la gingivitis", dijo. Steckl y el investigador asociado senior de la UC, Daewoo Han, colaboraron con Sancai Xie, científico principal de Procter & Gamble Co., y describieron sus resultados en un artículo publicado en la revista Sensors and Diagnostics de la Royal Society of Chemistry.
El equipo de investigación de Steckl ha estado explorando la biodetección para diversas aplicaciones. Estudiaron las hormonas del estrés en el sudor en colaboración con el Laboratorio de Investigación de la Fuerza Aérea en la Base de la Fuerza Aérea Wright-Patterson. Ahora están estudiando la saliva.
"Hay buenas razones para utilizar la saliva", afirmó. "Es relativamente abundante y fácil de obtener mediante métodos no invasivos. Y la saliva tiene muchos elementos importantes que pueden actuar como indicadores de la salud".
Las bacterias de la gingivitis pueden viajar a través del torrente sanguíneo, provocando enfermedades cardiovasculares y otros problemas de salud graves, dijo Steckl. Pero la saliva es un biofluido complicado, afirmó Han, autor principal del estudio.
Los investigadores pre-trataron la muestra con almidón de patata para eliminar una proteína llamada amilasa que podría interferir con los resultados de la prueba. Su prueba utiliza anticuerpos que reaccionan a las endotoxinas que se encuentran en las bacterias.
"Daewoo trabajó muy duro en muchos callejones sin salida antes de lograr el éxito", afirmó Steckl. "Les digo a mis alumnos que investigar es buscar, buscar e investigar hasta encontrar la respuesta".
Las pruebas de salud en el hogar han estado disponibles durante generaciones en usos específicos como la detección de embarazo. Pero la pandemia de COVID-19 introdujo a una amplia audiencia de consumidores el concepto de controlar su salud con nueva tecnología.
Se espera que la industria de las pruebas en el hogar genere 45 mil millones de dólares anuales para 2031, según Allied Market Research.
Steckl dijo que ve muchas oportunidades para nuevos productos de consumo. "Nuestros resultados definitivamente son prometedores", afirmó Steckl. "A veces resulta fácil. La mayoría de las veces hay que perseverar".
Conclusión resumen Hemos demostrado un ensayo de flujo lateral (LFA) tipo sándwich basado en anticuerpos para detectar P. gingivalis LPS, un importante biomarcador de la salud bucal. El dispositivo LFA tiene un LOD de aproximadamente 22 ng ml -1 para muestras acuosas y una selectividad excelente frente a otros LPS y proteínas salivales. La detección en saliva humana se evaluó en combinación con almidón de patata y filtrado con jeringa para reducir la interferencia de las biomoléculas en la saliva, especialmente las enzimas α-amilasa. Las reacciones de inmunoensayo de LFA con muestras de saliva dieron resultados comparables (LOD ~46,5 ng mL -1) a los de las muestras a base de agua. Se realizarán más desarrollos para mejorar la sensibilidad del ensayo utilizando muestras de saliva. También se explorará la capacidad de detectar múltiples moléculas de LPS relacionadas con enfermedades para realizar diagnósticos más precisos de la salud de los pacientes. Finalmente, debido a que la sensibilidad de la detección actual basada en anticuerpos se ve significativamente afectada por el rendimiento del anticuerpo conjugado, se investigará el desarrollo de LFA tipo sándwich basado en aptámeros para mejorar la flexibilidad y el rendimiento. El pretratamiento para muestras de saliva discutido anteriormente también se puede utilizar con los dispositivos LFA tipo sándwich basados en aptámeros. |