La investigación de Cedars-Sinai es la primera en descubrir cambios en la córnea relacionados con enfermedades y propone enfoques terapéuticos potenciales para corregir la cicatrización de heridas diabéticas.
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Resumen Objetivos/hipótesis La diabetes está asociada con modificaciones epigenéticas que incluyen la metilación del ADN y cambios en miARN. Las complicaciones diabéticas en la córnea pueden causar defectos epiteliales persistentes y problemas de cicatrización de heridas debido a la disfunción de las células madre epiteliales del limbo (LESC). En este estudio, nuestro objetivo fue descubrir alteraciones epigenéticas en células epiteliales limbares humanas (LEC) diabéticas frente a no diabéticas enriquecidas en LESC e identificar nuevos marcadores diabéticos que pueden ser el objetivo de la terapia para normalizar la cicatrización de heridas epiteliales corneales y la expresión de células madre. Métodos Se aislaron células epiteliales limbares humanas (LEC) o se obtuvieron córneas cultivadas de órganos, de ojos de autopsia de donantes no diabéticos (59,87 ± 20,89 años) y diabéticos (71,93 ± 9,29 años). Los grupos no fueron estadísticamente diferentes en edad. El ADN se extrajo de LEC para el análisis de metilación utilizando Illumina Infinium 850K MethylationEPIC BeadChip y la proteína se extrajo para el análisis de matriz de fósforo Wnt. La cicatrización de heridas se estudió usando un ensayo de raspado en LEC o heridas con 1-heptanol en córneas cultivadas de órganos. Las córneas cultivadas de órganos y LEC se transfectaron con ARNip de WNT5A, miR-203a imitador o inhibidor de miR-203a o se trataron con Wnt-5a recombinante (200 ng/ml), inhibidor de la metilación del ADN zebularine (1–20 µmol/l) o nanobioconjugados biodegradables (NBC) basados en andamiaje de ácido polimálico que contiene oligonucleótido antisentido (AON) para miR-203a o un control AON revuelto (15–20 µmol/l). Resultados Hubo una metilación diferencial significativa del ADN entre LEC diabéticos y no diabéticos. El promotor WNT5A estaba hipermetilado en LEC diabético acompañado de una proteína Wnt-5a marcadamente disminuida. El tratamiento de células epiteliales limbares humanas (LEC) diabéticas y córneas cultivadas de órganos con Wnt-5a exógeno aceleró la cicatrización de heridas en 1,4 veces (p<0,05) y 37 % (p<0,05), respectivamente, y aumentó la expresión de LESC y marcador diabético. El tratamiento con Wnt-5a en células epiteliales limbares humanas (LEC) diabéticas aumentó la fosforilación de los miembros de la vía no canónica dependiente de Ca2+ (fosfolipasa Cγ1 y proteína quinasa Cβ; en 1,15 veces [p<0,05] y 1,36 veces [p<0,05], respectivamente). En LEC diabéticos, el tratamiento con zebularina aumentó los niveles de Wnt-5a en 1,37 veces (p<0,01) y estimuló la cicatrización de heridas de manera dependiente de la dosis con un aumento de 1,6 veces (p<0,01) a las 24 h. Además, la zebularina también mejoró la cicatrización de heridas en un 30 % (p<0,01) en córneas cultivadas de órganos diabéticos y aumentó la expresión de LESC y marcadores diabéticos. La transfección de estas células con ARNip de WNT5A anuló la estimulación de la cicatrización de heridas por parte de la zebularina, lo que sugiere que su efecto se debió principalmente a la inhibición de la hipermetilación de WNT5A. El tratamiento de células epiteliales limbares humanas (LEC) diabéticas y córneas cultivadas con órganos con NBC mejoró la cicatrización de heridas en 1,4 veces (p<0,01) y 23,3 % (p<0,05), respectivamente, con una mayor expresión de LESC y marcadores diabéticos. Conclusiones/interpretación Brindamos el primer relato de los cambios epigenéticos en las córneas diabéticas, incluida la inhibición dual de WNT5A por la metilación del ADN y la acción de miARN. En general, Wnt-5a es un nuevo estimulador de la cicatrización de heridas del epitelio corneal que puede utilizarse para mejorar la cicatrización de heridas y las células madre en la córnea diabética. |
Comentarios
Investigadores de Cedars-Sinai han proporcionado una nueva comprensión de cómo la diabetes retrasa la cicatrización de heridas en el ojo, identificando por primera vez dos cambios en la córnea relacionados con la enfermedad.
Los hallazgos, publicados en la revista revisada por pares Diabetologia, también identificaron tres vías terapéuticas que revirtieron estos cambios y restauraron parcialmente la función de cicatrización de heridas en la córnea, un descubrimiento que en última instancia podría informar nuevos tratamientos para la diabetes.
"Descubrimos que la diabetes induce más cambios celulares de los que sabíamos anteriormente", dijo Alexander Ljubimov, PhD, director del Programa de Ojos en el Instituto de Medicina Regenerativa de la Junta de Gobernadores de Cedars-Sinai y autor principal del artículo. “El descubrimiento no afecta la secuencia del gen, pero implica modificaciones específicas del ADN que alteran la expresión del gen, lo que se conoce como alteraciones epigenéticas”.
Más de 37 millones de personas en los Estados Unidos, el 11 % de la población, tiene diabetes, un trastorno sistémico que puede provocar enfermedades renales, enfermedades cardíacas, amputaciones, derrames cerebrales y daños en los nervios. La mayoría de los medicamentos para la diabetes están diseñados para aumentar la tolerancia a la glucosa o suministrar la insulina agotada, pero no abordan los cambios moleculares y celulares ni sus complicaciones asociadas.
La nueva investigación también identifica por primera vez un papel importante de Wnt-5a, una proteína de señalización secretada que los investigadores encontraron responsable de la cicatrización de heridas en la córnea y la función de las células madre, células capaces de diferenciarse en muchos tipos de células.
“Los tratamientos actuales solo abordan los síntomas, por lo que existe una necesidad urgente de comprender los mecanismos moleculares de los problemas de cicatrización de heridas relacionados con la diabetes”, dijo Ruchi Shah, PhD, científico del laboratorio de Ljubimov y primer autor del estudio. “La comprensión de este novedoso mecanismo de curación de heridas regulado epigenéticamente podría conducir a tratamientos terapéuticos que podrían ayudar a los pacientes a evitar más problemas de salud ocular a largo plazo”.
Aunque gran parte de la atención de la enfermedad diabética del ojo está en la retina, hasta el 70% de los pacientes con diabetes sufren problemas de la córnea.
En la diabetes avanzada, las células madre de la córnea se vuelven disfuncionales y la córnea sana más lentamente y de forma menos completa después de una lesión o de procedimientos como la cirugía de cataratas y el tratamiento con láser para la retinopatía diabética.
Para identificar los cambios epigenéticos descubiertos en este estudio, cambios que no están integrados en el genoma desde el nacimiento, pero que se introdujeron más tarde, Ljubimov y su equipo compararon células de las córneas de seis pacientes diabéticos con las de cinco donantes sanos. Descubrieron que en las córneas diabéticas, el producto proteico del gen WNT5A estaba reprimido. Además, en muestras de diabéticos encontraron un aumento en el microARN que inhibe la WNT5A.
Luego, el equipo de científicos indujo heridas a las células de la córnea en cultivo y cultivos de órganos corneales, y probó tres intervenciones diseñadas para normalizar la expresión de la proteína Wnt-5a. Agregaron la proteína Wnt-5a directamente; introdujeron un inhibidor de la metilación del ADN, originalmente aprobado para tratar el cáncer; y se dirigieron a los niveles de microARN con un nuevo enfoque de terapia génica utilizando un compuesto a nanoescala. El equipo desarrolló el compuesto, que utiliza moléculas sintéticas para bloquear el microARN, como sustituto de una terapia génica viral que encontraron tóxica para las células madre.
Los tres métodos terapéuticos, en las muestras de diabéticos, estimularon la producción de marcadores de células madre y mejoraron la regeneración de tejidos, acelerando la cicatrización de heridas.
“Las nuevas terapias para revertir los efectos epigenéticos podrían mejorar la función de la córnea y también pueden resultar significativas en otras complicaciones diabéticas”, dijo Clive Svendsen, PhD, director de la Junta de Gobernadores del Instituto de Medicina Regenerativa y coautor del estudio. “Este trabajo ciertamente ayuda a hacer avanzar el campo”.
Los investigadores continuarán analizando sus datos para comprender mejor los mecanismos de WNT5A y otros genes relacionados con la cicatrización de heridas. También están estudiando una terapia combinada para apuntar tanto a la metilación del microARN como del ADN con la esperanza de que normalice más completamente la cicatrización de heridas al aumentar la proteína Wnt-5a.
“Nuestro objetivo es desarrollar medicamentos tópicos de liberación sostenida para la cicatrización de heridas en la córnea”, dijo Ljubimov. “Los medicamentos aprobados por la FDA [Administración de Alimentos y Medicamentos] y que podrían aplicarse fácilmente pueden ser uno de los enfoques más prometedores para futuras terapias efectivas”.
Financiamiento: este trabajo fue financiado por los números de subvención de los Institutos Nacionales de Salud R01EY013431482, R01EY031377, R01EY025377 y R01CA206220; y el Instituto de Medicina Regenerativa de la Junta de Gobernadores de Cedars-Sinai.