Investigación y ciencia | 09 SEP 20

Anales de la Fundación Alberto J. Roemmers

Resúmenes de trabajos destacados
Autor/a: María Catalina Olguin; Marta Delia Posadas; Gilda Celina Revelant; María Rosa Venezia. 
Evaluación del efecto de la yerba mate suplementada con polifenoles sobre el tejido óseo.
Introducción

El consumo de Ilex paraguariensis (yerba mate, YM) es muy popular en América del Sur (Argentina ~6.5 kg/persona/año)1. Varios fitoquímicos activos han sido identificados en extractos acuosos de YM: xantinas, polifenoles y saponinas1, 2, 3. Entre las xantinas se destaca la cafeína, mientras que entre los polifenoles predominan el ácido clorogénico y la rutina con efectos positivos sobre la salud1, 4, 5, 6,7. La cafeína en alta concentración tendría un impacto negativo sobre la densidad mineral ósea (DMO)8, 9, 10. Un meta-análisis indicó que el consumo de café está ligeramente, pero significativamente asociado a un mayor riesgo de fracturas, especialmente en las mujeres11. Este efecto negativo también se observó en animales de experimentación12. Por lo tanto, se podría pensar que el consumo de YM tuviese también efecto negativo sobre el hueso debido a su contenido de cafeína. En Argentina el 50% del consumo de cafeína es incorporado a través del mate13. Contrariamente, los polifenoles también presentes en la YM han demostrado efectos beneficiosos a nivel del tejido óseo14. Se halló asociación entre la pérdida ósea con la edad y el estrés oxidativo por la determinación de productos avanzados de oxidación de proteínas, malondialdehído (MDA) y superóxido dismutasa (SOD) en fémures de ratas jóvenes, adultas y de edad avanzada14, 15. Adicionalmente, se ha demostrado que alimentos ricos en antioxidantes pueden representar una estrategia para disminuir la pérdida ósea relacionada con la edad14, 16. Una publicación previa mostró mayor DMO en mujeres postmenopáusicas que tomaban al menos 1 litro de mate/día en comparación con controles que no bebían mate17. Nuestro grupo demostró un efecto positivo de la YM sobre la DMO y el volumen de hueso trabecular en animales alimentados con una dieta con hipocálcica18. Esto podría indicar que el efecto negativo de la baja ingesta de calcio en el volumen óseo se revierte, al menos en parte, por la YM.

El objetivo general del presente trabajo fue evaluar el efecto de la yerba mate suplementada con polifenoles sobre el tejido óseo. Entre los objetivos específicos nos planteamos  evaluar la morfometría ósea, la densidad mineral ósea, la histomorfometría ósea y la resistencia ósea.

Materiales y Métodos

Se llevó a cabo el experimento con ratas Sprague Dawley (n=27) provistas por el Bioterio Central de la Facultad de Ciencias Médicas de la UNR. Los animales se dividieron aleatoriamente en 3 grupos experimentales (n=9 por grupo) de acuerdo a lo que recibieron

como bebida: 1. grupo Control (n=9) que recibió agua; 2. grupo YM control (n=9) que recibió una infusión de YM control preparada con 5 g de yerba mate y agua a 70° C durante 5 min de exposición; 3. grupo YM concentrada (YM+) (n=9) que recibió una infusión de yerba mate con mayor contenido de polifenoles y mayor capacidad antioxidante preparada con 20 g de yerba mate y agua a 90° C durante 5 min de exposición.

Los animales se mantuvieron en un ambiente climatizado 24±1ºC, con periodo luz-oscuridad de 12 h y ciclos de ventilación cada 1 h. Todos los experimentos se llevaron a cabo acorde a las reglas internacionales de manejo de animales de laboratorio [Canadian Council on Animal Care Guidelines. Guide to the care and use of experimental animal].

Los animales se controlaron semanalmente (peso, consumo de líquido y alimento). El peso no mostró diferencias estadísticamente significativas. El consumo de líquido y alimento tampoco mostró diferencias significativas entre los grupos.

Finalizado los 90 días se sacrificaron los animales y se extrajeron las tibias, fémures y vertebras dorsales y lumbares. También se guardó plasma para las posteriores determinaciones bioquímicas. Los fémures y las vértebras fueron guardados a -20° C cubiertos con gasas humedecidas con solución fisiológica para las determinaciones biomecánicas. La tibia izquierda se radiografío para la posterior determinación de la DMO y parámetros morfométricos óseos. A continuación se cortó en forma transversal al 50% de la misma para obtener una sección de 2.5 mm de espesor a partir de las cuales se tomaron imágenes digitales para realizar las determinaciones morfométricas del tejido cortical. La parte proximal se colocó en EDTA 10% para descalcificar y posteriormente en 30-35 días proceder a la realización de cortes histológicos y determinar los parámetros de histomorfometría estática y conectividad trabecular.

Análisis de imágenes digitales: La digitalización de las imágenes se llevo a cabo mediante un microscopio (Olympus, Germany) con una cámara fotográfica adaptada (Olympus SP-350) y para el análisis se utilizó el software Image J 1.40 (NIH).

> Morfometría ósea: Se determinaron el largo y ancho de las tibias y fémures. Adicionalmente se realizaron cortes transversales de 2 mm de espesor al 50% de la longitud de la tibia sin descalcificar utilizando una sierra de baja velocidad para determinar: área seccional total, área cortical, área medular, perímetro perióstico y endóstico, diámetro total, diámetro medular y grosor cortical.

> Evaluación de la DMO y contenido mineral óseo: Se determinó por absorciometría dual de rayos X (DXA) con un equipo Hologic Discovery WI con un software para pequeños animales.

> Histomorfometría estática: se realizaron cortes histológicos con tinción de hematoxilina-eosina de la tibia izquierda previamente descalcificada con EDTA. Se evaluaron utilizando el software Image J 1.40 (NIH, USA): área total de tejido analizado (TV), área ocupada por hueso (BV) y perímetro de dicha área. Con estos valores se calcularán: porcentaje de tejido óseo: BV/TV (%), grosor trabecular, número de trabéculas y separación trabecular. Adicionalmente se evaluaron sobre las imágenes digitales los parámetros de conectividad trabecular. 

> Evaluación de la resistencia ósea: La evaluación de la resistencia ósea se realizó en los fémures a través del ensayo de flexión a tres puntos a nivel de la diáfisis se empleará para medir la resistencia del hueso cortical y ensayo de compresión vertebral.

> Perfil bioquímico: En plasma se determinaron parámetros de función hepática (GOT y GPT) y función renal (urea y creatinina) para evaluar la seguridad de la infusión concentrada. Adicionalmente se determinaronproteínas totales, polifenoles totales y parámetros de estrés oxidativo.

Resultados

Optimización de la infusión de yerba mate

Con el fin de optimizar la extracción de polifenoles y obtener una infusión con capacidad antioxidante incrementada para la realización de experimentos in vivo, evaluamos diferentes factores que pudieran influir en la extracción. Se utilizó un diseño factorial completo (2x2x3) con los siguientes factores y niveles: temperatura (70-90 °C), tiempo (5-20 minutos), cantidad de yerba mate (5-10-20 gramos). En todos los casos la infusión se preparó en un volumen de agua de 200 ml. De esta manera quedaron conformadas 12 unidades experimentales diferentes de infusiones de yerba mate. A cada una de ellas se le determinó el contenido de polifenoles totales (PFT) por el método de Folin-Ciocalteu y la capacidad antioxidante utilizando una solución de 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH). Esta última se expresó como  porcentaje de inhibición (radical DPPH neutralizado) calculado con la siguiente fórmula: (A-A1/A) * 100.

 

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