Investigación y ciencia | 09 SEP 20

Anales de la Fundación Alberto J. Roemmers

Resúmenes de trabajos destacados
Autor/a: María Catalina Olguin; Marta Delia Posadas; Gilda Celina Revelant; María Rosa Venezia. 
Efectos del agregado de polvo de arándanos a la dieta sobre manifestaciones del síndrome metabólico en ratas obesas beta
Introducción

El sobrepeso y la obesidad se encuentran entre los principales factores de riesgo de muerte y de enfermedad a nivel global. Anualmente fallecen unos 4 millones de personas adultas como consecuencia del exceso de peso; asimismo,  enfermedades crónicas no transmisibles (ECNT) pueden atribuirse al sobrepeso como es el caso de la diabetes (44%),  las cardiopatías isquémicas (23%), y entre el 7% y el 41% de ciertos tipos de cánceres; tanto en  países de ingresos altos como  de bajos y medianos con predominio en las regiones urbanas.(1-3)

Argentina no se aleja de esta realidad;  los datos de la 4 ª Encuesta Nacional de Factores de Riesgo (ENFR) llevada a cabo en 2018 nos muestran una  muestra una prevalencia de exceso de peso (sobrepeso + obesidad) del 61,6%,  en el caso de auto-reporte y del 66,1% para los valores obtenidos por mediciones. Se considera sobrepeso a un valor de IMC mayor o igual a 25 y menor a 30; para el caso de obesidad se toma un IMC mayor a 30. (4). 

Los organismos internacionales dedicados al estudio y la promoción de la salud sugieren cambios en los hábitos alimentarios para prevenir y paliar esta verdadera epidemia. Estas recomendaciones, que se asocian a un aumento en la actividad física son: disminución de la ingesta de azúcares, grasas saturadas y sal y aumento en el consumo de frutas, vegetales y grasas insaturadas, incluyendo el consumo de  alimentos naturales con compuestos bioactivos (5). De la ya mencionada 4ª ENFR surge que solamente un 6% de los encuestados cumple con la recomendación de consumir al menos cinco porciones de frutas o verduras por día.

Gran parte de los alimentos de origen vegetal, en particular las frutas son aportadores de sustancias con actividad biológica asociados a la generación de efectos positivos sobre la salud y reducir el riesgo de enfermedades crónicas como las mencionadas más arriba y de de alta prevalencia mundial. La actividad antioxidante característica de algunas frutas –tales como los frutos rojos- ha sido estudiada y sus efectos favorables informados van desde presentar una alta capacidad saciogénica hasta mejorar el perfil glucolipídico plasmático y hepático (6-13)

 Atendiendo a las recomendaciones nutricionales vigentes se decidió evaluar los eventuales efectos protectores del agregado a la dieta habitual de animales de experimentación, de compuestos con acciones antioxidantes y antiinflamatorias provenientes de arándanos desecados sobre la obesidad, la diabetes tipo 2 y composición corporal de una  línea endocriada de ratas IIMbBeta.

La línea de ratas IIMb/Beta desarrolla una obesidad no hiperfágica, definida tanto por el sobrepeso como por el volumen de los panículos adiposos, de grado moderado: 30% de masa grasa. La obesidad -que se manifiesta tanto cuando se alimentan los animales con la dieta formulada según el American Institute of Nutrition (AIN 93), como cuando consumen alimento balanceado comercial - es de instalación peripuberal, y afecta a ambos sexos con mayor notoriedad en los machos (14).

La manifestación corporal de la obesidad se acompaña con hipertriacilglicerolemia y resistencia insulínica progresando hacia la diabetes tipo 2 en la adultez. La colesterolemia total y sus fracciones se mantienen dentro de los límites normales.Este modelo murino de obesidad y dislipidemia ha demostrado marcada susceptibilidad a los cambios en la composición de la dieta, respaldando las recomendaciones  científicas internacionales de intervenir en el ambiente nutricional con el fin de mejorar la manifestación de la obesidad (15-17).

Objetivo

El objetivo de este proyecto consistió en evaluar los efectos del agregado a la dieta de sustancias antioxidantes, provenientes de arándanos desecados (Vaccinium myrtillus) sobre la obesidad -manifestada tanto por el peso corporal como por la distribución y magnitud del tejido adiposo-, parámetros bioquímicos indicadores del perfil glucolipídico, composición e histomorfología hepática en ratas macho púberes IIMb/Beta, a las que se les suministraron los compuestos bioactivos adicionados a la dieta AIN 93, desde la pubertad hasta la madurez.

Materiales y metodología

> Dietas

Las dietas se prepararon de acuerdo con AIN-93,  fueron isocalóricas e isolipídicas, difiriendo solamente en el tipo de grasa utilizada.

Dieta AIN (control): AIN-93M, con aceite de girasol.

Dieta JB: AIN-93M modificada reemplazando el aceite de girasol por primer jugo bovino (grasa bovina). El primer jugo bovino, según el Código Alimentario Argentino se define como el producto separado por fusión a temperaturas no mayores a 80 ° C de los tejidos y partes adiposas limpias e inalteradas de animales bovinos (18). La sustitución del aceite vegetal por esta grasa tiene como finalidad potenciar la expresión del síndrome característico de  esta línea de ratas.

Dieta JBAra: Dieta JB con jugo bovino en reemplazo del aceite de girasol y conteniendo 0,5g de polvo de arándanos desecados cada 100g de dieta.

El polvo de arándanos desecado fue provisto por la firma The Berry Store, San Luis 1858 de la ciudad de Rosario, que lo produce a partir de cultivos propios. La composición del producto, según el rótulo, es en g/100g: polvo de arándanos 89,6; glucosa 10,0; vitamina C 0,2; esencia de vainilla 0,1;  sorbato de potasio 0,1. El consumo diario recomendado es de 3,5 a 5,3 g.

El contenido de polifenoles del producto determinado con el método de Folin – Ciocalteu, expresado como ácido gálico, fue de 9,45 mg/g de polvo (19).

> Diseño experimental

Se emplearon 18 ratas macho de la línea IIMB/Beta (criadas en la cátedra de Biología de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Rosario) con valores iniciales promedio de: biomasa 238,79 ± 25,72 g,: glucemia (GLU) 119,68 ± 5,99 mg/dl; triacilgliceroles (TAG) 152,89 ± 30,39  mg/dl y colesterol total (COL) 111,32 ± 5,52 mg/dl.

Los animales, divididos aleatoriamente en 3 grupos de 6 recibieron las dietas durante 90 días. Se alojaron en jaulas individuales en condiciones habituales de criadero: acceso al alimento y al agua ad libitum, iluminación con fotoperiodicidad controlada (12 hs) temperatura ambiental (25° C ± 2 °C) e higiene diaria. La cría y la manipulación de los roedores se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo para el cuidado y uso de animales de experimentación del Instituto Nacional de Salud (NIH) de los EEUU y fue aprobado por el Comité de Bioética y de Bioseguridad de la Universidad Nacional de Rosario.

> Mediciones, análisis bioquímicos. Procedimientos analíticos

Día por medio se midieron la ingesta de alimento y el peso corporal.

Tres días antes del sacrificio se recolectaron materias fecales, en las que se determinaron: peso total, contenido de humedad y contenido de grasa en base seca.

Al final del experimento se recolectaron muestras de sangre tras 12 h de ayuno. Las muestras se extrajeron por punción cardíaca bajo anestesia (clorhidrato de ketamina 0,1 mg por 100g de peso corporal y maleato de acetopromazina 0,1mg/100g de peso corporal).

Los animales se eutanasiaron con sobredosis de pentobarbital sódico al 18% (10/12 mg/peso corporal) inyectado vía intraperitoneal (American Veterinay Medical Association Guides on Eutanasia. Formerly Report of the AVMA Panel on Eutanasia, 2007)

Se extrajeron los hígados y los panículos adiposos retroperitoneales y perigonadales, se lavaron con buffer fosfato y se pesaron.

Se calcularon los pesos relativos de hígado y panículos con la siguiente ecuación: Peso relativo de órgano = peso absoluto de órgano (g)/ peso corporal total (g)  x 100.

Se efectuaron determinaciones bioquímicas en plasma: GLU, TAG, COL, COL HDL y LDL;  alanino amino transferasa (ALAT), aspartato amino transferasa (ASAT), fosfatasa alcalina (FOH), uremia y creatininemia con técnicas enzimáticas espectrofotométricas.Muestras de hígados se procesaron en un  homogeneizador Potter-Elvejahn y se extrajeron los lípidos con cloroformo/metanol los que se cuantificaron gravimétricamente después de la evaporación de la mezcla de solventes (20).

Los TAG y el COL hepáticos se determinaron con los mismos procedimientos analíticos empleados para los lípidos plasmáticos.

Parte de los hígados extraídos  se procesaron histológicamente y se colorearon con hematoxilina eosina (HE) y PAS.

> Análisis estadísticos

Los resultados se expresan como promedio ± desviación estándar (x ± DS). Los datos se analizaron empleando ANOVA Para los análisis estadísticos se empleó el programa Graph Pad Prism Versión 3.02 (Abril 2000). Un valor de p menor a 0,05 (p <0,05) se consideró significativo.

Resultados

> Consumo de alimento y evolución de la biomasa

No se registraron diferencias significativas entre los grupos en el consumo de alimento, que fue en promedio de 40g diario. El grupo JBAra incorporó de este modo, 0,2 g de polvo de arándanos por animal. El aumento de la biomasa y el peso relativo de los panículos abdominales no difirieron entre los grupos. Se manifestó una diferencia significativa entre los grupos en el peso relativo del hígado, siendo mayor  en el JB.

Tabla 1
Consumo de alimento, aumento de biomasa y pesos relativos  (PR) de hígado, panículos adiposos retroperitoneales y perigonadales según la dieta consumida. *

  AIN   JB                       JBAra
Consumo de alimento (g) 3544 ± 225  a 3683 ±191   a 3648 ± 277  a
Biomasa final  (g) 497,9 ± 28,9 b 485,8 ± 31,5 b 510,9 ± 29,5 b
Aumento de biomasa (g)  259,4 ± 6,3   c 247,9 ± 12,8 c 271,0 ± 24,5 c
PR Hígado   3,822 ± 0,275  d 4,470 ± 0,656  e 3,767 ± 0,264  d
PR Retroperitoneales 4,993 ± 0,571  g 5,125 ± 0,463  g 5,398 ± 0,594  g
PR Perigonadales 3,088 ± 0,151  h 3,133 ± 0,459  h 3,441 ± 0,430 h
*Media ± desviación estándar; letras diferentes en la misma fila indican diferencia significativa (p <0,05).

 
>
Parámetros plasmáticos

Al finalizar los tratamientos no se constató diferencia entre los grupos en los niveles de GLU, TAG, COL (total y fracciones), ASAT, ALAT, FOH, urea y creatinina.

Tabla 2
Parámetros plasmáticos según la dieta consumida*. 

  AIN   JB                       JBAra
GLU (mg/dl) 209,8 ± 26,8  a 198,0 ± 4,9   a 242,4 ± 54,6 a 
COL (mg/dl) 174,8 ± 17,9   b 181,0 ± 35,6  b 167,9 ± 21,3   b
COL-HDL (mg/dl) 42,3 ± 5,9   c 52,7 ± 10,2  c 45,9 ± 6,15   c
COL-LDL (mg/dl)  86,0 ± 15,4   d 56,5 ±26,6   d 64,1 ± 8,8   d
TAG (mg/dl) 232,5± 84,8   e 306,8 ± 118,7e 288,9 ± 63,8   e
ALAT (UI) 21,5 ± 3,5      f 32,5 ± 10,8  f 34,7 ± 11,1   f
ASAT (UI) 84,0 ± 17,9   g 79,7 ± 17,9  g 94,4 ± 17,1   g
FOH (UI) 101,2 ± 19,2   h  128,3 ± 37,2  h 109,6 ± 30,9   h
Urea (mg/dl) 24,2 ± 1,6      i 24,6 ± 5,1     i 26,1 ± 4,9      i
Creatinina (mg/dl)   0,50 ± 0,08    j 0,51 ± 0,09   j 0,51 ± 0,08    j
*Media ± desviación estándar; letras diferentes en la misma fila indican diferencia significativa (p <0,05)


Materia fecal y excreción fecal de grasa 

El peso de la materia fecal, así como la cantidad de grasa excretada fueron significativamente mayores en el grupo JBAra. La absorción aparente de grasa (calculada como: Grasa ingerida- Grasa excretada/Grasa ingerida x 100) fue mayor en el grupo AIN.

Tabla 3
Materia fecal: peso; %  humedad; % grasa en base seca (GBseca), excreción de grasa diaria (ExG); porcentaje de absorción de grasa (AbsG) según la dieta consumida*

  AIN   JB                       JBAra
Peso (g)  5,47 ± 0,73 a 6,22 ± 1,48  ab 7,18 ± 0,63 b
Humedad (%) 13,33 ± 1,92 a 12,03 ± 3,03 ab 11,23 ± 1,48 b
GBseca (%) 0,90 ±0,285  a 1,93± 0,60 b 2,64 ± 0,73  c
Ex G (mg/día) 14,6 ± 5,18   a 35,1 ± 12,3 b 55,3  ±  16,0  c
AbsG (%) 99,30 ± 0,29   a 98,45 ± 0,51 b 97,76 ± 0,59  c
*Media ± desviación estándar; letras diferentes en la misma fila indican diferencia significativa (p <0,05)


>
Grasa total, COL y TAG hepáticos

El contenido de grasa total hepática fue significativamente inferior en el grupo JBAra.

El nivel de TAG hepáticos en JB y JB Ara, semejantes entre sí, fue significativamente menor que el de AIN.

La concentración de COL hepático fue significativamente menor en JBAra respecto de AIN y de JB, que no difirieron entre sí.

Tabla 4
Grasa total, TAG y COL hepáticos en 100g de órgano según la dieta consumida*.

  AIN   JB                       JBAra
Grasa (g/100g)  5,56 ± 0,846  a 5,53 ± 0,81 a   4,41 ± 0,87  b
TAG  (mg/100g) 1916 ± 425     a 1046 ± 145  b 890 ± 201   b
COL (mg/100g) 434,2 ± 24,7   a 386,0 ± 86,1 a 237,1 ± 42,8  b
*Media ± desviación estándar; letras diferentes en la misma fila indican diferencia significativa (p <0,05)

 

> Histología hepática

En AIN: abundantes macrovacuolas en zona periportal, abundantes microvacuolas en todas las zonas, hiperemia y aumento de glucógeno en zona periportal y centrolobulillar; grupo JB: abundante cantidad de macro y microvacuolas en todo el parénquima, marcada hiperemia, muy aislados cuerpos apoptóticos y presencia de glucógeno en zona periportal y centrolobulillar; grupo JBAra: menor cantidad de macrovacuolas, similar cantidad de microvacuolas y glucógeno aumentado en zonas periportal y centrolobulillar respecto de JB.

 Discusión 

Los efectos fisiológicos de los polifenoles con demostrada actividad antioxidante presentes en los frutos rojos, han sido estudiados en animales de experimentación, en seres humanos voluntarios así como en cultivos de células. Se ha verificado que estos compuestos se absorben en forma intacta, -manteniendo su bioactividad en la sangre- y son metabolizados a derivados metoxilados en hígado y riñón (21,22). La mayoría de estos estudios se han llevado a cabo en animales en los que la obesidad se indujo con dietas hiperlipídicas; empleando frutos enteros, frescos, desecados o congelados en altas proporciones. Los resultados son variados y contradictorios (23-26).

En este trabajo se evaluaron en ratas espontáneamente obesas -de la línea IIMb/Beta- los efectos del consumo de una dieta normolipídica (5% de lípidos) conteniendo sólo 0,5g de polvo de arándanos desecados cada 100g de dieta, sobre manifestaciones del síndrome metabólico.

Se registró un menor peso relativo del hígado y una menor concentración hepática de grasa total y COL. Estos resultados coinciden con los de Takikawa et al, quienes suministraron también durante 90 días, 2,7g de extracto de arándanos cada 100 de dieta a ratones KK.Ay de 5 semanas de edad (27).

Heyman et al. informaron mayor excreción de COL y TAG por materia fecal así como aumento en el peso del ciego en ratones C57BL/6 de seis semanas a los que se le había inducido la obesidad con una dieta con 45% de las calorías como grasa y proporcionado arándanos liofilizados en un 20% del peso de la dieta durante 13 semanas(28). En esta investigación se observó que la ingesta de polvo de arándanos modificó la absorción aparente de grasa, que fue significativamente menor en JBAra que en los otros grupos.

La biomasa, el consumo de alimento, el peso relativo de los panículos abdominales, la GLU y el perfil lipídico plasmático no mostraron diferencia entre los grupos. En el mismo sentido, Mykkänen et al, en un estudio llevado a cabo con ratones alimentados con dietas de alto contenido de grasa (45% de las calorías totales de la dieta) y 5 y 10% de arándanos enteros, no encontraron efectos sobre  parámetros vinculados a la instalación del sindrome obeso (28).

La disminución de la esteatosis hepática, así como la menor absorción de grasa dietaria que se registraron en el presente estudio, se lograron con una ingesta diaria de 0,2 g de polvo de arándanos, que aportan 1,9 mg de polifenoles. Se destaca que la concentración de polifenoles suministrada a los animales, equivaldría en el humano a un consumo diario de 40g de arándanos frescos cada 70 kg de peso corporal, cantidad que se enmarca dentro de las recomendaciones nutricionales internacionales que establecen un consumo de 20 a 60 g de arándanos desecados por día (7).

La ingesta de polvo de arándanos evaluada no representó un aumento significativo de la fibra dietaria, al que no podrían por lo tanto atribuirse los hallazgos mencionados. Los efectos reportados en los estudios de Mikkanen, de Heyman, y de otros, sí podrían derivarse -al menos en parte- del alto nivel de fibra empleado, dado que Lee et al, verificaron en ratas Wistar, modificaciones en la microbiota y la histomorfología intestinal como consecuencia del consumo de dieta con un 10% de polvo de arándanos (29).

De este modo, los efectos beneficiosos observados sobre manifestaciones del síndrome metabólico en el grupo JBAra serían atribuibles a los compuestos bioactivos presentes en el polvo de arándanos, por probables acciones sobre la microbiota intestinal.

Conclusiones 

La ingesta de polvo de arándanos en la dieta, aun conteniendo lípidos ricos en ácidos grasos saturados, produjo efectos beneficiosos sobre la esteatosis hepática y una menor absorción de la grasa dietaria en ratas espontáneamente obesas.

De la observación de la histología  hepática se puede expresar que  la dieta JBara1 incidió favorablemente en el perfil glucolipídico y que, en una segunda etapa, el agregado de polvo arándanos a la dieta JB promovió una reversión parcial de la esteatosis macrovesicular y un aumento de los depósitos de glucógeno en los hígados de animales tratados.


Autores: María Catalina Olguin; Marta Delia Posadas; Gilda Celina Revelant; María Rosa Venezia.

Institución:  Facultad de ciencias bioquímicas y farmacéuticas y Facultad de ciencias médicas. Universidad nacional de Rosario


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