Diversos estudios de laboratorio, de imágenes e histopatología son necesarios para distinguir a la AVB de las demás cusas de colestasis neonatal.
Bilirrubina total y directa, transaminasas, fosfatasa alcalina, gammaglutamyl transpeptidasa y 5'nucleotidasa sérica no son suficientes para diferenciar con exactitud una hepatitis neonatal de una AVB.
La ecografía es el primer estudio por imágenes para lactantes con ictericia prolongada, debido a su fácil acceso y a la capacidad de detectar un quiste de colédoco, precisar el tamaño y forma de la vesícula biliar y de la vía biliar extrahepática así como también identificar malformaciones asociadas (poliesplenia o asplenia, trastornos que se asocian a la atresia biliar). Sin embargo la ecografía abdominal no puede detectar hepatitis, y la existencia o no de vesícula no incide en el diagnóstico de atresia biliar
Centellografía hepática (test de IDA): en la actualidad es un método de rutina en todo niño con ictericia obstructiva. El tecnesio (Tc99m IDA) o fósfoto (P.P.IDA) marcados permite, en algunos casos, confirmar la existencia de drenaje biliar al intestino. La ausencia del marcador en el intestino delgado dentro de las 24 horas indica atresia biliar. La sensibilidad de la centellografía hepatobiliar es del 100%, pero la especificidad es únicamente del 46% al 88%, porque los pacientes con un sistema biliar permeable pueden no excretar colorante en cantidades detectables dentro del
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