Inducción y caracterización de fenotipo colesterogénico mediante la tecnología de CRISPRon.

> Sensibilidad a estatinas

Finalmente, se estudió la sensibilidad a las estatinas en los modelos generados. Específicamente, se realizaron ensayos de MTS en las células MCF-7TC y MCF-7/CR luego de 48 horas de tratamiento con SIM o Lova, como se describió con anterioridad (Figura 10).

No se encontraron diferencias entre las líneas con el tratamiento  con  Lova (gráfico  de la derecha), ya que se puede observar un efecto Platou entre las distintas concentraciones de esta droga. Por otro lado, en los ensayos con SIM, se puede observar que las células MCF-7/CR responden levemente en la concentración más alta utilizada (40 µM).
 

Figura 10: Ensayos de viabilidad (MTS) en las células MCF-7/TC y MCF-7/CR tratadas con simvastatina (SIM) y lovastatina (Lova) por 48 horas. ANOVA de dos vías, seguido de test de Tukey (*p<0,05 MCF-7/CR 10uM vs MCF-7/CR 40uM). Se muestra la media ± EEM de 3 experimentos independientes.

> Expresión de HMGCR en otros modelos de células madre

Se evaluó la expresión a nivel transcripcional de HMGCR en la línea de células madre embrionarias WA-09 y la línea de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) FN2.1. Interesantemente, se observó que, tanto las células MCF-7/CR como las líneas de células madre normales WA-09 y FN2.1 exhibieron niveles elevados de HMGCR al ser comparadas a la línea control MCF-7/TC (Figura 11.A).

Luego, se buscó evaluar si esto ocurría también en modelos de CMTs. Por lo tanto, se eligió un panel de líneas celulares derivadas de gliomas enriquecidas en CMTs y ampliamente caracterizadas, y se compararon con las células MCF-7/TC y MCF-7/CR. Se encontró gran variabilidad entre las líneas, pero en la mayoría de los casos, los niveles de expresión de HMGCR fueron mayores que los obtenidos en la línea MCF-7/TC (Figura 11.B). Estos datos sugieren que HMGCR podría ser relevante para el mantenimiento de “estados” de célula madre tanto pluri como multipotentes, ya sea en células normales o tumorales.
 

Figura 11: Análisis de expresión de HMGCR total por RT-qPCR en células madre comparado a las células del sistema CRISPR. A. Líneas pluripotentes normales WA-09 y FN2.1. B. Líneas de CMTs G01, G02, G03, G04, G05, G07, G08 y G09. Test de Kruskal-Wallis, seguido del Test de Dunn (*p<0,05 vs. MCF-7/TC). Se muestra la media ± EEM de 3 experimentos independientes.

Los resultados de este trabajo aportan datos sobre el rol de HMGCR en CM y particularmente su contribución hacia la generación de estados CMTs. Por otro lado, se buscó aportar evidencia que permitiera el reposicionamiento de las estatinas como posibles agentes anti-CMTs.

Como ya se mencionó, las células tumorales requieren grandes cantidades de colesterol, por lo que aumentan su captación (induciendo la expresión de su receptor LDLR) o activan la síntesis de novo, es decir la vía del MVA. Hace unos años, Clendening y colaboradores demostraron el potencial oncogénico de HMGCR al transfectar células tumorales y no tumorales con variantes desreguladas de esta proteína, es decir un sistema de sobreexpresión ectópico, y propusieron a HMGCR como un posible oncogén⁽⁴⁸⁾.

En este trabajo se decidió optar por un modelo que imite de manera más fidedigna la sobreexpresión de HMGCR observada en algunos tipos tumorales. Para ello, se buscó activar la expresión endógena de este gen utilizando un sistema CRISPRon. Esta estrategia ha demostrado ser útil para activar genes en distintos tipos celulares, incluyendo células madre^{(42) (49) (50) (51)}. Más aún, esta tecnología se ha aplicado exitosamente en células de leucemia mieloide crónica para activar genes supresores tumorales⁽⁵²⁾ y en células de melanoma para determinar genes responsables de resistencia a drogas⁽⁵³⁾. Ya que el sistema CRISPRon puede ser utilizado para identificar genes involucrados en distintos aspectos de la biología tumoral, se decidió emplearlo para estudiar si HMGCR es capaz de inducir, o al menos facilitar, la aparición de estados CMT en CM.

En primer lugar, se demostró que el sistema CRISPRon fue capaz de aumentar los niveles de HMGCR total, de la isoforma de tamaño completo (HMGCR-FL) y de una variante que carece del exón 13 (HMGCR-del13) en la línea celular MCF-7 (Figura 5). El exón 13 codifica una parte del dominio catalítico de esta enzima, y en esta región se encuentran algunos residuos importantes para la unión de los sustratos y de las estatinas⁽⁴⁸⁾, por lo que se ha reportado que esta variante presenta actividad enzimática reducida⁽⁵⁴⁾.

Se encontraron dos SNPs (single nucleotide polymorphism), rs3846662 y rs12654264, asociados al splicing alternativo de HMGCR, favoreciendo la variante que carece el exón 13 (55) (56). Por otro lado, se ha demostrado que esta isoforma tiene menor respuesta a estatinas que la variante de tamaño completo^(55)(57)(58). Esto también fue analizado en estudios de interacción, donde se comprobó que la eficiencia de unión de la isoforma HMGCR-del13 con varias estatinas, incluyendo SIM y Lova, es aproximadamente la mitad que con la variante HMGCR-FL⁽⁵⁷⁾.

En este trabajo, se encontró que las células con inducción de la expresión de HMGCR (MCF-7/CR) presentan una respuesta baja al tratamiento con SIM y nula con Lova (Figura 10). Se podría pensar que el aumento de la expresión de la variante HMGCR-del13 en las células MCF-7/CR podría influir de alguna manera en la respuesta a estatinas observada en este sistema.

Luego, se evaluó la capacidad de las células MCF-7/TC y MCF-7/CR de crecer en forma independiente de anclaje, una de las características distintivas de las células malignas. Para ello, se utilizó el ensayo de crecimiento de colonias en agar blando (Soft-agar assay), que se basa en la capacidad de las células de crecer y formar colonias en medios semisólidos (Figura 9.A).

Si bien no se pudo cuantificar el número de colonias en cada tipo celular, experimentos similares realizados por otros autores determinaron que la sobreexpresión de HMGCR en la línea MCF-7 efectivamente aumenta el número de células capaces de generar colonias, es decir, presentan mayor tumorigenicidad in vitro. Utilizando este ensayo, los autores también demostraron la capacidad transformante de HMGCR en la línea epitelial mamaria inmortalizada MCF-10A.

Además, estos resultados también se observaron en células hepG2 en ensayos tanto in vitro como in vivo⁽⁴⁸⁾, sugiriendo que el potencial tumorigénico de HMGCR no estaría limitado a CM. Cabe destacar que en este trabajo se utilizaron transfecciones transitorias y los períodos de incubación requeridos en los ensayos de soft-agar son prolongados. Tal como  se observó  por  RT-qPCR, los niveles de HMGCR a los seis días post-transfección son similares a los controles de transfección, lo que podría justificar que no se pudieran apreciar diferencias en tamaño o morfología de las colonias entre ambos tipos de células.

Por otro lado, se realizaron ensayos de proliferación, sin encontrarse diferencias significativas entre ambos tipos celulares (Figura  9.B). Resultados similares fueron reportados para células hepG2 con sobreexpresión de HMGCR⁽⁴⁸⁾. Sin embargo, lo contrario se observó en células de cáncer pancreático con sobreexpresión de esta enzima⁽⁵⁹⁾. Por lo tanto, hacen falta más estudios para determinar si el rol de HMGCR sobre la proliferación es dependiente del tipo de tumor o si hay otros factores que influyan.

Uno de los ensayos más utilizado para enriquecer los cultivos de CMTs en distintos tipos de tumores, incluyendo CM, es el ensayo de formación de esferas, un ensayo funcional de la actividad de células madre basado en la premisa de que sólo las células indiferenciadas derivadas de epitelio mamario pueden sobrevivir en suspensión mientras que las células diferenciadas mueren por anoikis⁽⁴⁶⁾.

Se realizaron ensayos de dilución límite para evaluar el efecto de la inducción de HMGCR sobre la fracción de células capaces de formar mamoesferas. Utilizando un software especializado, es posible comparar la fracción de células capaces de formar mamoesferas entre distintos cultivos o condiciones⁽⁴⁷⁾, por ejemplo las células del sistema CRISPRon.

En este trabajo se observó una tendencia a mayor frecuencia de formación de mamoesferas en las células MCF- 7/CR con respecto al control de transfección, lo que sugiere un aumento en el número de células madre o progenitoras inducida por HMGCR (Figura 6). Estos datos son compatibles con la bibliografía, donde se demuestra de manera inversa al abordaje experimental de este trabajo, la relación entre la vía del MVA y la formación de tumoroesferas: genes de la vía del MVA se encontraron sobreexpresados en esferas derivadas de líneas tumorales de colon y CM respecto a las células crecidas en monocapa. Por otro lado, se demostró que el tratamiento con estatinas disminuye el número de células capaces de formar esferas^{(31) (32) (33)}.

La proteína transmembrana CD133 se utiliza también como marcador de células madre en tumores, por lo que se incluyó su análisis en este trabajo. Se encontró una tendencia a mayor número de células CD133+ en MCF-7/CR (Figura 7.B), aportando más evidencia sobre el rol de HMGCR en la adquisición de características de CMT. Resulta interesante destacar que este marcador también se ha asociado a tumores de CM con  características más agresivas, como carcinomas invasivos⁽⁶⁰⁾ y a células con resistencia a terapia hormonal⁽⁶¹⁾.

Recientemente, un estudio clínico en CM demostró que tanto los niveles de expresión a nivel transcripcional como proteico de CD133 fueron particularmente elevados en tumores triple negativos y con sobreexpresión de Her2 y que células CD133+ presentan mayor capacidad de invasión y potencial metastásico, reforzando la relación entre este marcador y la progresión tumoral⁽⁶²⁾. Más aún, estudios en cáncer de páncreas han demostrado que células CD133+ son resistentes a la quimioterapia y son responsables de la invasión, lo que les permite permanecer quiescentes en presencia de fármacos terapéuticos y ocasionar la recurrencia tumoral luego del tratamiento⁽⁶³⁾.

Distintos estudios han confirmado que, al igual que las células madre normales, las CMTs pueden permanecer en estados quiescentes. Dado que las drogas quimioterapéuticas atacan preferentemente a las células proliferativas, como las células diferenciadas de la masa tumoral, las CMTs podrían escapar de este destino al entrar en estos estados latentes o quiescentes (dormancy)^{(10) (64)}. En este contexto, se ha descripto un tipo muy interesante de CMT quiescente con altos niveles de CD133⁽⁵⁸⁾.

Los datos expuestos son compatibles con los resultados obtenidos en la línea MCF-7/CR, donde se observaron tendencias a mayor número de células CD133+ y mayor migración pero sin cambios en la proliferación.

Las células expuestas a compuestos tóxicos pueden desarrollar resistencia, lo que implica una gran limitación para el éxito de la quimioterapia. Uno de los mecanismos por los cuales las células tumorales adquieren dicha resistencia es la sobreexpresión de genes de la familia ABC (ATP- binding cassette), que codifican proteínas de membrana que actúan como bombas facilitando la entrada y salida de diversas moléculas de la célula⁽⁶⁵⁾.

Uno  de estos transportadores es la proteína  BCRP  (Breast Cancer  Resistance  Protein, también  llamada  ABCG2)  que  se  encuentra altamente expresada en líneas de CM resistentes a drogas⁽⁶⁶⁾ y su sobreexpresión se ha asociado a fenotipos CMT⁽⁶⁴⁾. Por otro lado, varias líneas de evidencia vinculan a BCRP con la vía del MVA: se encuentra en los lipid rafts de las membranas celulares (junto al colesterol y a CD133), la depleción de colesterol disminuye  su actividad y pacientes con hipercolesterolemia presentan elevados niveles de BCRP⁽⁶⁷⁾.

Por otro lado, se demostró que el tratamiento con atorvastatina disminuye la expresión de BCRP, varias estatinas son sustratos de los transportadores ABC y las estatinas pueden modular la expresión de BCRP y por lo tanto su eficacia y toxicidad⁽⁶⁷⁾. Un estudio muy interesante demostró que el tratamiento con lovastatina en células tumorales pancreáticas CD133+ indujo quimiosensibilidad y disminuyó la diseminación metastásica, dos de las principales características de las CMTs⁽⁶³⁾.

Dada la relación entre el colesterol, CD133 y BCRP se decidió analizar la expresión de BCRP en el sistema CRISPR. Sin embargo, no se encontraron diferencias entre las células MCF-7/CR y MCF-7TC (Figura 8). Un estudio demostró que la línea MCF-7 resistente a adriamicina (o doxorrubicina, quimioterapéutico) aumenta la expresión de varios marcadores de CMTs, incluyendo otro de los transportadores de tipo ABC, denominado ABCB1⁽⁶⁸⁾. Por lo tanto, hacen falta más estudios para entender la implicancia de HMGCR en la resistencia a drogas, y si se encuentra mediada por la sobreexpresión de otros transportadores ABC, distintos al analizado en este trabajo.

La determinación de la población CD44+/CD24-, es uno de los ensayos más utilizados y mejor definidos para identificar a las CMTs en CM. Por lo tanto, se evaluó a la población CD44+/CD24- en el sistema CRISPRon, encontrándose una pequeña tendencia a mayor número de células MCF- 7/CR con este fenotipo (Figura 7.A). CD44 es una molécula de superficie que media la interacción entre las células y la matriz extracelular, y por lo tanto está implicada en la adhesión celular y la migración⁽¹⁰⁾.

Como se mencionó extensamente en este trabajo, las CMTs son las responsables de colonizar nuevos tejidos y generar metástasis. Por lo tanto, el aumento de células CD44+/CD24- es compatible con la menor adhesión y mayor migración observada en las células MCF-7/CR (Figura 9.C y D). Es decir HMGCR estaría, por un lado, aumentando la tumorigenicidad de las células y por otro facilitando la progresión de un tumor in situ a uno invasivo, y posteriormente metastásico.

En este contexto, se han encontrado células tumorales CD44+/CD24- en la médula ósea de pacientes con CM⁽⁶⁹⁾ y el uso combinado de estos marcadores también permitió predecir sobrevida total y sobrevida libre de metástasis en pacientes con CM⁽⁷⁰⁾. Más aún, se encontró que el fenotipo CD44+/CD24- es más frecuente en tumores basales que en el resto de los subtipos de CM^{(71) (72)}.