Anales de la Fundación Alberto J. Roemmers

> Fundamentación del problema

La leishmaniasis es una enfermedad infecciosa en expansión en nuestro continente y es considerada por la Organización Mundial de la Salud como una de las enfermedades olvidadas (neglected diseases) por afectar principalmente a las poblaciones más pobres y con un limitado acceso a los servicios de salud.
Hasta el momento no se cuenta con una vacuna para la prevención de la leishmaniasis en humanos [1], y se dispone de escasos fármacos para su tratamiento. Las altas dosis de antimoniales pentavalentes administrados por vía intramuscular, altamente doloroso, conlleva a un alto grado de abandono por parte de los pacientes.

Por la problemática anteriormente mencionada, surge la necesidad de desarrollar desde el sector científico-académico nuevas e innovadoras alternativas terapéuticas, basadas en la prevención de la infección por medio de inmunoterapias utilizando vacunas de primera generación (preparadas con fracciones del parásito, o parásitos enteros muertos) y tercera generación (preparadas con proteínas recombinantes del parásito).

> Marco teórico

Las vacunas de primera generación se plantean como una estrategia económica en la producción de antígenos vacunales para nuestra región. En este tipo de vacunas, los antígenos se obtienen por medio del lisado del patógeno para posteriormente cuantificarlos y formularlos con el adyuvante adecuado. Ensayos clínicos conducidos en el año 2004 en Venezuela por el Dr. Jacinto Convit [2] demostraron que una vacuna de primera generación, basada en antígenos totales obtenidos desde promastigotes de Leishmania (Viannia) braziliensis muertos por pasteurización y adyuvantizados con el bacilo de Calmette-Guérin, fue segura y eficaz para el tratamiento de la leishmaniasis mucocutanea y cuntánea difusa.

En el año 2013 el Dr. Wilson Mayrink publicó los resultados de un ensayo clínico randomizado y controlado, llevado a cabo en el sudeste de la República Federativa de Brasil, para evaluar la eficacia y seguridad de una vacuna de primera generación basada en antígenos totales de L. amazonensis sin adyuvante en su formulación [3].

Este trabajo demostró, una reducción significativa de la incidencia de la enfermedad en el área de vacunación en comparación con el área de aplicación del placebo, durante el periodo 2004-2011. Además el estudio demostró que una formulación vacunal, basada en antígenos de una sola especie del genero Leishmania (vacuna mono-especie), es capaz de reducir la incidencia de la leishmaniasis cutánea en el área endémica de la enfermedad.

El desarrollo de nuevas estrategias vacunales se tiene que basar en los recientes avances en el conocimiento de la respuesta inmune innata. La respuesta inmune innata puede ser activada por diversos patrones moleculares asociados a patógenos a través de la activación de los TLR, determinando esta activación un papel importante en la dirección de la respuesta inmune adquirida.

Estudios pre clínicos desarrollados por nuestro equipo de trabajo, demuestran que el ARN sintético de doble cadena, Poly (I:C), formulado con antígenos totales de L. amazonensis desencadena una respuesta inmune protectora del tipo Th1 caracterizada por la producción de IgG2a e IFN-g [4]. Además de los agonistas sintéticos de los TLR, las emulsiones agua en aceite, basada en aceites metabolizables no minerales y un emulsionante, presentan todas las cualidades de una adyuvante moderno, seguro y eficaz.

Hemos demostrado que los antígenos totales de L. amazonensis formulados con una es una emulsión agua/aceite basada en manitol y ácido oleico, Montanide ISA 763, genera una respuesta inmune protectora del tipo Th1, frente a la infección por L. amazonensis [5].

> Hipótesis

Teniendo en cuenta las consideraciones mencionadas en los apartados referidos al Problema de Investigación y al Marco Teórico, el presente proyecto se enfocará en la siguiente hipótesis de trabajo: “La inmunización con antígenos totales de L. amazonensis formulados en forma conjunta con una emulsión agua en aceite y un agonista de TLR como adyuvantes, inducen una respuesta inmune protectora en ratones BALB/c capaz de controlar la infección por L. amazonensis.”

Para probar esta hipótesis, se proponen los siguientes objetivos específicos:

1. Producir antígenos totales (ATL) de L. amazonensis por procesos de congelamiento/descongelamiento, sonicación, autoclavado y pasteurización.
2. Inmunizar ratones BALB/c con una vacuna basada en ATL, producidos por ciclos de congelamiento/descongelamiento, sonicación, autoclavado y pasteurización, formulados con un ligando TLR3 [Poly (I:C)].
3. Analizar la respuesta inmune humoral y celular generada por cada formulación vacunal.
4. nmunizar ratones BALB/c con una vacuna basada en ATL de L. amazonensis, formulados con Poly (I:C) y una emulsión agua en aceite [Montanide ISA 763] como adyuvantes.
5. Analizar la respuesta inmune humoral y celular generada por cada formulación vacunal.
6. Evaluar la protección conferida por las distintas formulaciones vacunales en ratones BALB/c, después de la infección experimental con formas infectantes de L. amazonensis.

> Objetivo 1:

1.1- Producción de antígenos totales (ATL) de L. amazonensis

Los ATL se obtuvieron por cuatro procesos:

1. congelamientos/descongelamiento de promastigotes de L. amazonensis,
2. sonicación de promastigotes de L. amazonensis,
3. pasteurización de promastigores de L. amazonensis y
4. autoclavado de promastigotes de L. amazonensis.

Los promastigotes de L. amazonensis (MHOM/VE/84/MEL) fueron recolectados de cultivos estacionarios (día 7), lavados en buffer fosfato-salino (PBS), posteriormente fueron resuspendidos en PBS y sometidos a:
• Seis ciclos de congelamiento (-80°C) descongelamiento (56°C).
• Un ciclo de sonicación a 40W, 1 min y 0 ?C.
• Un ciclo de pasteurización a 56°C por 30 minutos.
• Un ciclo de autoclavado a 15 psi por 30 minutos. 

La determinación de la concentración de proteínas totales de los ATL se efectuó mediante el Kit BCA Protein Assay. Los ATL se analizaron por SDS-PAGE, con el fin de evaluar la integridad de los constituyentes proteicos de los antígenos (Figura 1).

Figura 1. SDS-PAGE al 12,5% teñido con Coomasie Blue, donde se pueden observar los perfiles antigénicos generados por 60 μg de cada ATL comparado con el cultivo de promastigotes de L. amazonensis (fresco). ATLa: antígenos totales de Leishmania autoclavados, ATLc: antígenos totales de Leishmania congelados/descongelados, ATLp: antígenos totales de Leishmania pasteutizados, ATLs: antígenos
totales de Leishmania sonicados.

Los ATL obtenidos por sonicación presentaron una perfil antigénico mas conservado y con una amplia gama de peso molecular comprendidas entre los 250 kDa y 25 kDa, al compararlo con el cultivo de promastigotes de L. amazonensis (fresco).

> Objetivo 2:
Se utilizaron ratones hembras BALB/c de 45-60 días de edad. Los protocolos de experimentación que involucran animales se encuentran evaluados y aprobados por el CICUAL de la Facultad de
Ciencias Médicas de la UNCuyo (CICUAL Aval N° 80/2016). Los mismos consisten en un régimen
de dos dosis (prime/boost homólogos) para cada grupo experimental o control a intervalos de 21 días.
Las formulaciones vacunales se administraron por vía subcutánea en la región interescapular de cada
ratón.

Este protocolo está diseñado para evaluar la influencia del proceso de obtención de antígenos de primera generación sobre la inmunogenicidad de los ATL formulados con Poly (I:C) para luego seleccionar el lote de ATL que genere mayor respuesta inmune. Se inmunizaron grupos de 6 ratones, a dosis de los ATL fue de 100 μg y 50 μg del agonista de TLR3.

> Objetivo 3:
La inmunización con ATLs generó mayores niveles de IgG total (Figura 2A). Al analizar los isotipos IgG1 e IgG2a, se registraron incrementos estadísticamente significativos en los niveles de IgG1 en el grupo inmunizado con ATLs y una mayor tendencia en la producción de IgG2a (Figura 2B)

Figura 2. Respuesta inmune humoral generada por cada formulación vacunal. Los ratones fueron inmunizados dos veces con intervalos de 3 semanas. Las muestras de suero se recogieron en el día 36 del protocolo de inmunización y se determinó los niveles de IgG específica (A) y de los isotipos IgG1 e IgG2a por medio de un ELISA (B). Cada barra representa los valores medios de absorbancia a 450 nm ± SE de 5 ratones por grupo. Los asteriscos sobre cada barra indican diferencias significativas en comparación con el grupo control. **, P <0,01; ***, P <0,001.

De acuerdo a los resultados generados, se decidió producir los ATL a través de un ciclo de sonicación a 40W, 1 min y 0°C, para luego formularlos con 50 μg Poly (I:C) y evaluar la respuesta inmune generada en animales inmunizados bajo el mismo protocolo de inmunización.

No se registraron diferencias estadísticamente significativas en la producción de IgG total entre las formulaciones ATLs y ATLs-Poly (I:C), indicando esto que la formulación de los ATLs con Poly (I:C) no genera un incremento en los niveles de IgG total (Figura 3A)

Figura 3. Respuesta inmune humoral generada por cada formulación vacunal. Los ratones fueron inmunizados dos veces con intervalos de 3 semanas. Las muestras de suero se recogieron en el día 36 del protocolo de inmunización y se determinó los niveles de IgG específica (A) y de los isotipos IgG1 e IgG2a por medio de un ELISA (B). Cada barra representa los valores medios de absorbancia a 450 nm ± SE de 5 ratones por grupo. Los asteriscos sobre cada barra indican diferencias significativas en comparación con el grupo control. *,P<0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001

Al analizar los isotipos IgG1 e IgG2a, podemos observar una disminución estadísticamente significativa en los niveles de IgG1 y un amento en los niveles de IgG2a cuando los ATLs son formulados con Poly (I:C).

El isotipo IgG1 se correlaciona con el perfil inmunológico Th2 y el isotipo IgG2a se correlaciona con un perfil Th1, el cálculo de la razón IgG2a/IgG1 nos ayuda a definir el fenotipo de las células T, Th1 o Th2, generado luego de una inmunización. Un valor de la razón IgG2a/IgG1 inferior a 1 nos indica un perfil inmunológico del tipo Th2.