Anales de la Fundación Alberto J. Roemmers

Informe final 

En este proyecto proponemos explorar la relación entre la enfermedad de Parkinson y los cánceres de próstata y melanoma desde un abordaje molecular y celular, centra´ndonos principalmente en el estudio de la implicación de proteínas de la familia de las sinucleínas en procesos asociados al desarrollo de tumores.

En primer lugar se propuso estudiar el efecto de la modulación de los niveles de expresión de estas proteínas sobre el crecimiento celular y las capacidades migratorias e invasivas de las células tumorales.

Con el objeto de alcanzar los primeros objetivos se realizaron los siguientes abordajes:

> Caracterización de los niveles de expresión basales de alfa, beta y gama-sinucleína en distintas líneas celulares de cáncer de próstata y melanoma:

a) Se realizaron nuevos estudios bioninformáticos que indican que la expresión de alfa-sinucleína podría tener un valor pronóstico en pacientes con melanoma. Estos datos están en concordancia con observaciones similares descritas en la bibliografía que asocian la expresión de alfa-sinucleína con la evolución tumoral de melanoma hacia estadios más agresivos [1].

b) Se crecieron las siguientes líneas celulares de melanoma: A375, Colo829, SKMel28, 4434, 5555 y B16 (las tres primeras de origen humano, las últimas de origen murino); y las líneas celulares de cáncer de próstata humano PC3, DU145 y LNCaP.

c) Se realizaron extractos proteicos para la inmunodetección por Western Blot de los distintos miembros de la familia en las líneas celulares mencionadas. Los resultados preliminares indican que todas las líneas evaluadas muestran niveles detectables de expresión de alfa-sinucleína y niveles variables de expresión de gama-sinucleína. No se evalúa la expresión de beta-sinucleína porque no disponemos a la fecha de anticuerpo para reconocer a ese miembro de la familia.

Respecto a la detección de alfa-sinucleína, nuestros resultados preliminares sugieren que alguna/s de las líneas celulares de melanoma podrían mostrar la presencia de formas de alto peso molecular de alfa-sinucleína (dímeros, tetrámeros). Este resultado necesita ser explorado en mayor profundidad ya que resulta de sumo interés para el desarrollo del proyecto de investigación.

d) Se visualizó por inmunotinción y microscopía de fluorescencia, la expresión en células de melanoma y cáncer de próstata de alfa y gamma-sinucleína.

e) Se realizaron preparaciones de ARN de todas las líneas celulares en estudio para evaluar los niveles de expresión de los mensajeros por RT-PCR. En estos momentos se está poniendo a punto la reacción de PCR a partir de los cADNs sintetizados para proceder posteriormente a la cuantificación mediante  mediantemediante RT-PCR.

f) Durante los últimos meses se puso a punto la realización de geles de poliacrilamida en condiciones nativas, y pudimos observar claramente la presencia de especies de alfa-sinucleína de alto peso molecular en extactos proteicos provenientes de células de melanoma B16 y A375. La existencia de formas de sinucleína de alto peso molecular concuerda con otras observaciones descritas previamente en la literatura en otras líneas celulares [1].

g) Se realizó un fraccionamiento subcelular a partir de células de melanoma utilizándose la técnica de lisis secuencial, que permite conseguir una fracción proteica citoplasmática, una fracción de proteínas unidas a membranas y una última fracción nuclear. A través de estos ensayos hemos comprobado que el mayor porcentaje de alfa-sinucleína se encuentra unida a membrana y en citosol. Escasa cantidad de esta proteína fue detectada en la fracción nuclear. Estos resultados son aparentemente contradictorios con observaciones de otros grupos en las que describen la presencia de alfa-sinucleína nuclear en células de melanoma [2] y con la observación de cierta cantidad de esta proteína en la región nuclear (o perinuclear) detectada por técnicas de inmunofluorescencia y microscopía confocal. Posteriores estudios determinarán a qué compartimento subcelular se encuentra asociada esta proteína. Estos estudios incluyen visualizaciones por microscopía confocal y fraccionamientos subcelulares en gradientes de sacarosa. Resta por confirmar si la banda de mayor peso molecular corresponde a la forma tetramérica de esta proteína [3] o bien si es el resultado de una reacción inespecífica del anticuerpo utilizado. Esta banda de mayor peso molecular se observa también en extractos provenientes de células de neuroglioma y neuroblastoma (datos no mostrados), pero se ha programado el uso de anticuerpos alternativos para determinar la especifidad de la señal observada.

Con respecto a la proteína gamma-sinucleína, hemos realizado un primer fraccionamiento de células de melanoma que sugiere que la localización subcelular de esta proteína parecería estar estrechamente determinada por la especie molecular en que se encuentre la misma, distribuyéndse de distinta manera la especie monomérica y la especies de mayor peso molecular en las diferentes fracciones subcelulares. La presencia de distintas formas de alto peso molecular de esta proteína también fue descrita previamente en la bibliografía [4,5].   

> Generación de líneas celulares con niveles aumentados y disminuidos de sinucleínas.

a) Se diseñaron estrategias de silenciamiento por shARN para alfa- beta- y gamma-sinucleína (tanto de origen murino como humano). Se generaron constructos para proceder al silenciamiento. Muestras de los plásmidos generados se enviaron para su secuenciación con el objeto de verificar la incorporación de la secuencia deseada.

b) Los plásmidos generados con shARN para alfa y gamma-sinucleína se utilizaron para transfectar células B16, A375 (melanoma) y PC3 (próstata), generándose líneas con la expresión disminuida de alfa y gamma-sinucleína.

c) Se verificó la correcta disminución en la expresión de alfa-sinucleína por Western Blot en las tres líneas celulares utilizadas.

d) Se prepararon plásmidos de expresión de alfa, beta y gamma-sinucleína fusionada al epítope V5 para transfectar células y conseguir líneas celulares con niveles de expresión de estas proteínas aumentados. Con estos plásmidos se consiguió generar líneas que expresan más niveles de alfa y gamma-sinucleína. También se transfectaron células de melanoma y próstata con una versión de alfa-sinucleína fusionada a GFP.