Efectos del Escitalopram sobre la hiperfosforilación de Tau

Introducción

En la enfermedad de Alzheimer (EA), la quinasa GSK-3beta (glycogen synthase kinase-3beta) es la principal responsable de la hiperfosforilación de la proteína tau, debido a la inhibición de las moléculas PI3K/Akt, que controlan la actividad de la enzima, lo que se traduce en un aumento de esta.

Este mecanismo subyacente a la EA determina que tau, proteína que interacciona con los microtúbulos y los estabiliza para permitir su ensamblaje en el citoesqueleto, en el estado hiperfosforilado, forme ovillos neurofibrilares, proceso celular que comprende una serie de eventos conducentes a la neurodegeneración y muerte neuronal.

Entre ellos, se destaca la disminución del transporte axonal y la alteración de la plasticidad sináptica en neuronas del hipocampo, lo que concuerda con la aparición de demencia en personas de edad avanzada con EA y el deterioro cognitivo observado en modelos con animales. En consecuencia, evitar la alteración en la fosforilación de tau parece ser fundamental para controlar el avance de la EA.

En este sentido, se ha determinado que la hiperfosforilación de la isoforma de mayor extensión de tau (tau 441), expresada de manera estable en células embrionarias renales humanas HEK293 (human embryonic kidney cells) por efecto de forskolina, es disminuida por escitalopram, un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS). Si bien, se desconocen en este modelo las vías moleculares implicadas, se ha comprobado que el deterioro cognitivo en la EA se encuentra asociado con el déficit de serotonina (5-HT) y su receptor (5-HT1AR), localizados en el hipocampo.

De importancia significativa, es la capacidad de los ISRS, en particular, la fluoxetina, de modular la cascada de señalización PI3K/Akt/GSK-3beta, mediante la activación de PI3K/Akt (impide su bloqueo provocado por estrés celular) y la inhibición de GSK-3beta (estudios preclínicos), la cual es producida, asimismo, por agonistas de 5-HT1AR, 8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)-tetralina (8-OH-DPAT).

En este tipo de estudios, se ha observado que los ISRS logran disminuir la concentración de la forma del péptido beta-amiloide (Abeta) que es nociva para las neuronas y, estimular la neurogénesis en el hipocampo y la producción de neurotrofinas, entre ellas, el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, brain-derived neurotrophic factor).

El objetivo del presente trabajo fue determinar la capacidad del escitalopram para reducir la hiperfosforilación de tau provocada por la forma Abeta1-42 y la implicancia de 5-HT1AR y Akt/GSK-3beta, en este proceso.

Métodos

Como modelo de estudio, se utilizaron las neuronas hipocampales derivadas de cerebros de embriones de ratas hembras de la cepa Sprague-Dawley, de día 18. Los cultivos primarios crecieron en medio Neurobasal, al cual se adicionó L-glutamina (0.5mM), suplemento B27 (2%) y antibióticos (penicilina y estreptomicina [20 UI/ml]), bajo condiciones de presión de CO2 del 5% y temperatura de 37°C, en un incubador humidificado.

En dichos cultivos neuronales (2 semanas de crecimiento con una pureza cercana al 95%), se indujo la hiperfosforilación de tau mediante la preparación Abeta1-42 (cúmulos de filamentos de oligómeros Abeta1-42) y fueron tratados de manera alternativa con escitalopram, R-citalopram, fluoxetina, 8-OH-DPAT, LY294002 y WAY-100635.

Los efectos exhibidos por estos tratamientos se evaluaron por medio de diversos procedimientos como inmunoelectrotransferencia(western blotting), para la detección de tau, GSK-3beta y Akt y, sus respectivas isoformas fosforiladas: pTau (en Ser [serina] 396 o Thr [treonina] 231), pGSK3-beta (en Ser 9) y pAkt (en Ser 473 o Thr 308).

En dicho procedimiento, las proteínas totales (20 ug), obtenidas a partir de lisados celulares, fueron separadas en geles de poliacrilamida y SDS y transferidas a membranas de PVDF. Estas membranas fueron incubadas con los anticuerpos primarios específicos y la detección de las distintas proteínas se llevó a cabo mediante la reacción del sustrato (ECL Western blotting reagents) con la enzima peroxidasa del rábano conjugada al anticuerpo secundario.

La concentración de las proteínas estudiadas se determinó por medio del programa informático, Quantity One. Asimismo, el efecto de los tratamientos en las espinas dendríticas y dendritas fue evaluado mediante inmunofluorescencia y la subsiguiente microscopía confocal (Olympus FV 1000).

En el análisis estadístico, se aplicaron análisis de varianza de una vía y la prueba de Tukey. Un valor de p < 0.05 determinó la significancia estadística.