Rotavirus: Acción de la ciclooxigenasa y las prostaglandinas

Se encuentran niveles elevados de prostaglandinas (PG), productos de las ciclooxigenasas (COX), en el plasma y en las heces de los niños infectados por rotavirus. Pretendemos determinar el papel  de las COX, las PG y las vías de transducción de señal involucradas en la infección por rotavirus para elucidar los posibles nuevos objetivos de la terapia antiviral. Se infectaron células intestinales humanas Caco-2 con rotavirus humano Wa o rotavirus simiano SA-11. Se determinaron la expresión de ARNm de COX-2 y los niveles secretados de PGE22 en diferentes momentos posinfección y se estudió el efecto de los inhibidores COX sobre la infección por rotavirus por medio de un ensayo de inmunofluorescencia (IFA). Para revelar las vías de transducción de señal involucradas, se analizaron el efecto de MEK, la proteín cinasa A (PKA), la proteín cinasa p38 mitógeno-activada (MAPK) y los inhibidores de NF-κB sobre la infección por rotavirus. En las células Caco-2 infectadas, se detectó un incremento en la expresión del ARNm COX-2 y en los niveles secretados de PGE2. La indometacina (inhibiendo tanto COX-1 como COX-2) y los inhibidores específicos de COX-1 y COX-2 redujeron la infección por rotavirus en un 85 y 50%, respectivamente, medido con IFA. La indometacina redujo la infección por el virus en un paso posenlace temprano en el ciclo de la infección, inhibiendo la síntesis de proteína del virus. No parece que la indometacina afecte la síntesis viral de ARN. Los inhibidores de MEK, PKA, p38 MAPK y NF-κB disminuyeron la infección por rotavirus en por lo menos el 40%. PGE2 contrarrestó el efecto de los inhibidores COX y PKA pero no el de los inhibidores MEK, p38 MAPK y NF-κB. Concluyendo, COX y PGE2 son mediadores importantes de la infección por rotavirus en un paso posenlace. La vía ERK1/2 mediada por PKA está involucrada en la inducción de COX por la infección de rotavirus. Las vías MAPK y NF-κB están involucradas en la infección por rotavirus pero de una forma independiente de PGE. Este reporte ofrece nuevas perspectivas en la búsqueda de agentes terapéuticos en el tratamiento de la diarrea severa en niños generada por rotavirus.

Rotavirus-un miembro de la familia Reoviridae-es un virus no encapsulado, con ARN de doble-cadena.  Es la causa única más importante de gastroenteritis viral severa y algunas veces fatal y de diarrea deshidratante en niños alrededor del mundo. Cada año, el rotavirus causa aproximadamente 111 millones de episodios de gastroenteritis que requieren solo cuidado ambulatorio, 25 millones de consultas médicas, 2 millones de hospitalizaciones y 352,000 a 592,000 muertes (mediana, 440,000 muertes) en niños menores de 5 años de edad. A la edad de 5 años casi todos los niños alrededor del mundo habrán tenido un episodio de gastroenteritis por rotavirus, 1 en 5 asistirán al médico, 1 en 65 serán hospitalizados y aproximadamente 1 en 293 morirán como resultado de la infección. Los niños en países no desarrollados corresponden al 82% de las muertes por rotavirus (referencia 44 y las referencias en ese artículo).

El rotavirus generalmente se replica en enterocitos maduros del intestino delgado, liderando la inducción de la expresión del gen del virus y una variedad de citocinas inflamatorias, reducción de la expresión del gen del enterocito  y vacuolización (6, 8, 48). Recientemente, se ha reportado que el rotavirus puede entrar en el interior del cuerpo de los niños infectados, resultando en antigenemia y posiblemente viremia (5). Este hallazgo es importante para la comprensión de la patogénesis de la infección por rotavirus, la cual sólo se conoce en forma incompleta, a pesar de su prevalencia y estudios extensos en diferentes modelos animales.

Previamente, se han reportado niveles elevados de prostaglandinas (PG) PGE2 y PGF2 en el plasma y en las heces de los niños infectados con rotavirus (66), indicando que las ciclooxigenasas (COX) y  las PG pueden estar involucradas en la patogénesis del rotavirus. Las COX son enzimas esenciales en la biosíntesis de PG. Ellas convierten el ácido araquidónico, liberado por los glicerofosfolípidos de membrana por la  fosfolipasa A2, a PGH2. Los isómeros específicos luego transforman PGH2 a PG biológicamente activas tales como PGE2 y PGF2 (12, 22).

Dos genes distintos, COX-1 y COX-2, codifican dos COX respectivas. COX-1 es expresada constitutivamente en la mayoría de las células, incluyendo las células de las criptas intestinales. Recientemente, se han identificado nuevas variantes splice de COX-1 (PCOX1a, PCOX1b, y COX-3) y se encontró que se expresaban en una gran cantidad en el cerebro y el corazón (9). La expresión de COX-2 se puede inducir en una variedad  de células tales como células epiteliales y macrófagos (15, 26, 31, 55). La expresión de COX-2 parece ser altamente regulada por varias de proteín cinasas mitógeno-activadas (MAPK) y los  factores de trascripción, en especial, NF-κB (3, 17, 41, 49, 57). Además, la infección con muchos virus, incluyendo el virus herpes (29, 33, 34, 59, 67), virus pox (43), virus de la leucemia de las células -T humanas (37) y el virus de la leucemia bovina (BLV) (47), ha sido asociado con la modulación de la expresión de COX-2 y la producción de PG.

PG sirven como segundos mensajeros que producen un amplio rango de respuestas fisiológicas en células y tejidos. Especialmente, se conoce que las PG de la serie E tienen propiedades inmunomoduladoras. Además de mediar los síntomas inflamatorios, las PG pueden ejecutar efectos anti-inflamatorios. Por ejemplo, PGE2 inhibe la secreción del interferón gamma, una citocina que tiene actividad antiviral (23), y cambia la respuesta inmune hacia un perfil de citocina tipo-Th2 (interleucina-4 e interleucina-5), siendo menos efectiva en el desarrollo de una respuesta antiviral (4). Además, la PGE2 tiene un efecto estimulante en la replicación del virus, incluyendo el virus herpes (1, 29, 59, 60, 68) y BLV (47). En contraste, se sabe que PGE2 inhibe la replicación del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) en macrófagos (24) y está asociada con una pérdida sostenida de la replicación viral en pacientes con hepatitis B crónica (61).

Las principales PG, PGE1 y PGE2, pueden ser convertidas a PG ciclopentenonas (cyPG) PGA1 y PGA2, respectivamente (42). Se ha mostrado que cyPG tienen actividades biológicas diferentes a las de las PG primarias. CyPG inhiben la replicación de una variedad de virus, incluyendo tanto virus DNA como virus ARN (51). De forma interesante, la infección por rotavirus es inhibida por PGA1 (58).

Actualmente, no hay disponible ninguna vacuna efectiva contra el rotavirus. La vacuna tetravalente-rotavirus rhesus atenuada viva Rotashield, la primera vacuna contra el rotavirus con licencia, fue retirada del mercado mundial a finales de 1999 debido a un incremento en la incidencia de intususcepción (16, 39). Esto, junto con los diferentes niveles de eficacia asociados con el uso de algunos rotavirus atenuados vivos desarrollados para la administración oral (2, 28), apunta a la necesidad del desarrollo de estrategias alternativas para la prevención y/o tratamiento de la enfermedad diarreica por rotavirus. En este estudio, determinamos si la infección por rotavirus de las células Caco-2 influenciaba la expresión de ARNm COX-2 y la secreción de PGE2. Además, se estudió el efecto de los inhibidores COX Y PGE2 sobre la infección por rotavirus en las células Caco-2. También, se analizó el efecto de los inhibidores de las vías conocidas que median la regulación de la actividad COX sobre la infección por rotavirus de las células Caco-2. Los resultados mostraron claramente que COX y PGE2 son mediadores tempranos importantes de la infección por rotavirus y que la inhibición de la actividad COX o la síntesis de PG bloquean la infección por rotavirus en un paso posenlace, como fue medido por un ensayo de inmunofluorescencia (IFA).  Estos hallazgos pueden llevar a una nueva estrategia de tratamiento para la enfermedad diarreica por rotavirus.

Materiales y Métodos

Células, medio de cultivo, virus y reactantes. Las células Caco-2 se mantuvieron en un medio de Eagle modificado de Dulbecco’s (DMEM; GibcoBRL, Paisly, Escocia) que contenía 10% (vol/vol) suero fetal de ternero (FCS; Integro, Dieren, Holanda), 100 U de penicilina/ml, 100 μg de estreptomicina/ml y 1% (vol/vol) de amino ácidos no esenciales (BioWhittaker, Verviers, Bélgica) a 37°C y 5% de CO2.
La cepa de rotavirus humano Wa, la cepa de rotavirus simiano SA-11 y el antisuero policlonal (K3ppIV) contra a cepa de rotavirus simiano SA-11 fueron proporcionados gentilmente por M. Koopmans (Bilthoven, Holanda). El suero fue preparado inoculando conejos con rotavirus SA-11 parcialmente purificado (usando ultracentrifugación) originado de células MA-104 infectadas. Se conoce que la inoculación usada contiene proteína NSP4; por lo tanto, este suero también reconoce la proteína NSP4. Además, el antisuero reacciona cruzadamente con la cepa de rotavirus humano Wa usada en este estudio. El anticuerpo monoclonal anti-β-tubulina y la indometacina, NS-398, KT-5720, PD09859, U0126, PGE2, ditiocarbamato de pirrolidina (PDTC) y SB203580 fueron comprados en Sigma- Aldrich (St. Louis, Mo.). Se obtuvo SC-560 de Calbiochem (San Diego, Calif.). Los posibles efectos citotóxicos de los inhibidores y sus solventes, fueron probados, usando el reactante de proliferación celular WST-1 y el kit de detección de citotóxidad de deshidrogenasa láctica (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) ensayos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todos los inhibidores se usaron a concentraciones que no tóxicas para las células.