El rol de la microbiota | 24 MAR 19

Cólicos infantiles, inflamación intestinal y disbiosis

Estudio de caso control anidado para el análisis de datos clínicos y de laboratorio de bebés con y sin cólicos
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Autor/a: J. Marc Rhoads, James Collins, Nicole Y. Fatheree y colaboradores Journal of Pediatrics 203 · August 2018
INDICE:  1. Página 1 | 2. Referencias bibliográficas
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Introducción

El cólico infantil, definido como 3 horas de llanto + molestia durante más de 3 días por semana en un bebé <3 meses, afecta al 10%-15% de la población infantil normal.1

Prácticamente todas las revisiones concluyen que no existe una etiología establecida para los cólicos, aunque se postularon la alergia a la leche, el reflujo esofágico, la migraña, los déficits en el procesamiento sensorial y las dificultades para una lactancia efectiva.2-4

Varios grupos de investigación encontraron previamente evidencia de disbiosis, o una comunidad microbiana intestinal anormal en estos bebés.5-7 La disbiosis se ha asociado con una variedad de enfermedades gastrointestinales humanas, como el síndrome del intestino irritable y la enfermedad inflamatoria intestinal.8

Los autores sugirieron que las alteraciones microbianas en los cólicos se asocian con la inflamación intestinal, medida por la calprotectina fecal, una proteína antimicrobiana liberada a partir de neutrófilos entéricos utilizados para la valoración de la inflamación intestinal. Sin embargo, estudios anteriores han mostrado niveles similares de calprotectina fecal en lactantes con y sin cólicos.9

Las mediciones secuenciales de calprotectina en bebés con cólicos han mostrado consistentemente una reducción a medida que mejoraba el llanto, 10,11 pero algunos han sugerido que este es un fenómeno normal del desarrollo.12,13

Uno de los factores de confusión en la hipótesis de la inflamación intestinal-disbiosis para el cólico es que los bebés que reciben leche materna pueden tener niveles más altos de calprotectina fecal que los alimentados con fórmula, 14 aunque esto no se ha encontrado de manera consistente.13

Anteriormente los autores informaron que los niveles de calprotectina en la leche materna representaban aproximadamente el 1% de los niveles fecales.15

Los bebés que toman leche materna pueden tener una población microbiana diferente con una diversidad alfa (número de especies) en comparación con las de las fórmulas para lactantes, lo que complica las conclusiones sobre la diversidad cólica y microbiana.16

En el informe actual, los autores abordaron 2 preguntas: ¿Se relacionan los cólicos con la inflamación intestinal y la disbiosis? O, alternativamente, ¿los niveles elevados de calprotectina y la microbiota anormal son artefactos producidos por los efectos del tipo de leche y un microbioma neonatal desarrollado de forma incompleta?

Métodos

Este estudio anidado de casos y controles de lactantes (de 21 a 90 días de edad) incluyó lactantes enrolados en 2 ensayos previos de los autores aleatorios, doble ciego, controlados con placebo6,11 o enrolados como controles pareados por edad que no lloraron > 3 horas / día.

Todas las muestras fueron procesadas y analizadas de forma idéntica al inicio del estudio antes de recibir el producto del estudio (probiótico o placebo) en ambos ensayos. Todos los autores tuvieron acceso a los datos del estudio y revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Evaluaron el llanto mediante una técnica validada, el diario Barr, 6,17 y requirieron demostración de un promedio mayor de 3 horas de llanto y molestia (no consecutivo) durante 2 de 3 días.

Los estudios fueron aprobados por el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en la Junta de Revisión Institucional de Houston (HSC-MS-10-0048 y HSC-MS-11-0203) y registrado en ERA Commons (Clinicaltrials.gov: NCT01279265 y NCT01849991).

El reclutamiento se realizó a través de los consultorios locales de pediatras y de las clínicas de la Universidad de Texas-Houston. La publicidad fue a través de correos, cobertura de medios y un sitio web. Los padres de los bebés que no tenían cólicos también proporcionaron un diario de Barr.

Los autores excluyeron a los bebés con <32 semanas de gestación, falta de crecimiento, enfermedad pulmonar, diarrea, fiebre o consumo previo de un probiótico o antibiótico. Los bebés amamantados fueron suplementados con vitamina D, sin otros suplementos.

Las pruebas de detección incluyeron 65 individuos, 37 con cólicos y 28 sin cólicos. Los evaluadores de muestras y datos se cegaron al proceso y al análisis para cada individuo. Todas las muestras de heces fueron procesadas para análisis de microbiota fecal; 13 fueron excluidos del análisis de calprotectina fecal debido a una cantidad inadecuada para las pruebas.

> Análisis microbiano de heces

Los padres recolectaron una muestra de heces dentro de las 48 horas de la consulta. Las muestras fueron subdivididas y almacenadas a -80° C. Se extrajo el ADN utilizando el Mini Kit de ADN de Heces QIAamp (Qiagen, Valencia, California).

La secuenciación de ADN fue realizada por el Grupo de Recursos de Genómica Microbiana de la Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Louisiana.

La región hipervariable V4 de 16S rADN fue amplificada por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores específicos de genes con adaptadores Illumina: 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA y 805R GGACTACHVGGGTWTCTAA.

Se realizó la identificación taxonómica y el análisis de las secuencias del gen V4 16S rRNA utilizando QIIME (http://qiime.org) y R (R versión 3.4.3) con las bibliotecas Phyloseq (v1.22.3; https://github.com/joey711/ phyloseq) y Tidyverse (v1.2.1; https://www.tidyverse.org/contribute). Cabe señalar que, aunque las heces se recolectaron al inicio de diferentes estudios, se secuenciaron de la misma manera.

Calprotectina fecal

Las heces fueron procesadas y analizadas de acuerdo con el protocolo del fabricante por medio del kit de la prueba ligada a enzimas inmunoabsorbente de calprotectina fecal. El nivel de calprotectina se expresó como µg/g de peso de las heces. Los ensayos se realizaron con el mismo kit (Eagle Biosciences, Nashua, New Hampshire), un ensayo con alta reproducibilidad para heces congeladas.11,15

Análisis estadístico

Las características de los pacientes se compararon utilizando la prueba t de 2 muestras cuando se distribuyen normalmente (las variables se informaron como media ± DE) o utilizando la prueba de la suma de rangos de Wilcoxon si las variables no se distribuyeron normalmente (se informaron como medianas con RIC).

La correlación de la calprotectina fecal y el tiempo de llanto + molestia fue realizada ajustando un modelo de regresión lineal a los datos normalizados y fue reportada utilizando un coeficiente de correlación de Pearson. Se utilizaron correlaciones de Spearman para describir relaciones entre variables continuas no distribuidas normalmente.

Se determinaron diferencias en la composición microbiana entre grupos de las muestras utilizando métricas múltiples, incluyendo diversidad alfa por el número de especies observadas y los índices de diversidad de Shannon  y Simpson.

La diversidad beta fue evaluada utilizando el análisis no paramétrico de la varianza molecular implementado en el paquete Vegan R (v2.4.5).

La abundancia de taxones fue comparada con las pruebas de suma de rangos de Wilcoxon para la comparación por pares y las pruebas de suma de rangos de Kruskal-Wallace para las comparaciones implicando >2 grupos. La corrección de Benjamin-Hochberg fue utilizada para controlar para múltiples pruebas.

Los modelos de clasificación aleatorios de Forest incluyeron la unidad taxonómica operacional relativa (UTO), edad, uso de bloqueadores de ácido, calprotectina fecal, y tipo de alimentación utilizando el paquete aleatorio Forest R y 20000 formas y 9 variables en cada división.

También se realizó un subanálisis para casos y controles emparejados por edad (±5 días). Los niveles de calprotectina fecal se compararon entre los pares emparejados utilizando una prueba de rangos con signo de Wilcoxon. La significancia estadística se asumió con una tasa de error tipo 1 del 5%.

Resultados

Las características basales de los bebés elegibles para el análisis de microbiota fecal no demostraron diferencia significativa entre los grupos con cólicos y los grupos normales en términos de edad gestacional, edad, sexo, raza y etnicidad, aunque hubo una tendencia hacia más bebés caucásicos en el grupo cólico.

Todos los niños fueron a término o prematuros tardíos y de aproximadamente 2 meses de edad al momento de la inscripción.

El tiempo de llanto + molestia fue de aproximadamente 5 horas en el grupo con cólicos y <1 hora en el grupo control.

Calprotectina fecal en bebés con cólicos

Para probar la inflamación intestinal, los autores analizaron los niveles de calprotectina fecal en función de los cólicos. En el análisis univariable, los niveles de calprotectina fueron 7 veces más altos entre los lactantes amamantados (mediana, 183; RIC, 234) en comparación con los bebés alimentados con fórmula (mediana, 23,7; RIC, 97,7) o lactantes alimentados con leche de fórmula + leche materna (mediana, 107; RIC, 109) (P = 0,031).

Sin embargo, los modelos multivariables ajustados tanto para cólico como para alimentación demostraron una asociación independiente de la calprotectina con los cólicos (p <0,001), pero no con la fuente de la leche.

Debido a que el llanto + el tiempo de molestia fue el factor determinante para la clasificación de los cólicos, también se asoció con la calprotectina fecal en modelos de correlación o regresión univariables. Sin embargo, cuando se estratificó por estado del cólico, no hubo correlación significativa entre el llanto + el tiempo de molestia y los niveles de calprotectina.

Aunque la edad tampoco se asoció con el nivel de calprotectina en los modelos de los autores, se realizó un subanálisis para confirmar que la pequeña diferencia de edad estadísticamente no significativa entre los casos y los controles no estaba confundiendo los resultados.

Realizando la correspondencia de casos y controles por edad (± 5 días) se dio lugar a 13 pares emparejados, incluidos 8 pares (62%) que tenían una diferencia de edad dentro de un rango ± 1 día. Los niveles de calprotectina fueron mayores en los casos en comparación con sus controles pareados por edad (diferencia de mediana, 204,9 µg/g de heces); rango, -349,1 a 1002,1; P=0,016).

Los modelos multivariables no pareados de raíz cuadrada transformaron los niveles de calprotectina, ajustando por los efectos independientes del estado del cólico, el tipo de alimentación, el tiempo de llanto + molestia y la edad, y los efectos interactivos del tipo de cólico y de alimentación, dando como resultado al cólico como el único predictor independiente de los niveles de calprotectina fecal (β=9,74; intervalo de confianza 95%, 2,96-16,53). Eso se traduce en niveles de calprotectina que fueron 95 µg/g más altos en los bebés con cólicos que en los bebés sin cólicos.

Composición microbiana fecal en bebés con cólicos

Diversidad alfa. Los autores encontraron que la riqueza intestinal bacteriana alfa medida por el número de especies, fue significativamente mayor en muestras de cólicos que en los controles (P=0,025); sin embargo, ambos índices de diversidad de Shannon y Simpson no fueron significativamente diferentes en los bebés con cólicos en comparación con los controles.

Sin embargo, la diversidad alfa se vio afectada significativamente por el modo de alimentación, con la mayor diversidad en los bebés alimentados exclusivamente con fórmula y la más baja en los controles amamantados (Shannon, P=0,.0001; Simpson, P=0,0004).

Microbiota. Los autores notaron que las muestras de heces tenían muy alta variabilidad de muestra a muestra, lo que ya habían reportado previamente, 11 probablemente debido a la naturaleza de la microbioma neonatal. Examinaron el 99,99% de las UTOs más abundantes, lo que redujo sus datos a 5 filos: Actinobacterias, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacterias y Verrucomicrobia.

Las muestras de los bebés con cólicos se caracterizaron por una disminución significativa en la abundancia relativa de Actinobacteria (P=0,032) y un aumento marginal pero no estadísticamente significativo de Proteobacterias (P=0,07) en comparación con los bebés normales. No hubo efecto del modo de alimentación en la composición entre los 5 filos principales a esta edad temprana (datos no mostrados).

Más del 95% de los tipos de Actinobacterias fueron atribuidos a Bifidobacterium en estos lactantes. La abundancia relativa del género Bifidobacterium entre las bacterias totales se redujo de una mediana de 10,1% (RIC, 19,4) en lactantes normales a 0,3% (RIC, 5,8) en bebés con cólicos (P=0,049).

En el nivel UTO, las UTOs clasificadas como Lactobacillus iners y Acinetobacter con nombre de nivel de especie desconocido se encontraron en forma significativa en proporciones más altas de muestras de cólicos y a una significativamente mayor abundancia que en las muestras de control (utilizando la prueba de 2 muestras para la igualdad de proporciones y las pruebas de suma de rangos de Wilcoxon).

L iners fue detectado en 26 de 37 bebés (70%) con cólicos, pero en solo 8 de 28 muestras de control (29%; P=0,002). Se detectó Acinetobacter en 30 de 37 muestras de bebés con cólicos (81%) y en 11 de 28 de controles (39%; P=0,0014).

Diversidad Beta. Se utilizaron distancias unifrac no ponderadas para evaluar la diversidad beta entre muestras. Las diferencias entre los grupos se evaluaron utilizando un análisis no paramétrico de la varianza molecular.

Los resultados mostraron que la microbiota fecal de los bebés con cólicos se superpone pero está claramente separada de la composición de los bebés normales (P <0,0001; r2=0,051).

Por lo tanto, los autores encontraron una transición de la microbiota de bebés normales a bebés con cólicos. La diversidad beta también se vio afectada levemente por el tipo de alimentación (P=0,016; r2=0,050).

Influencia potencial de los bloqueantes de ácido en la composición microbiana o en la calprotectina fecal

Debido a que los bebés con cólicos frecuentemente vomitan, los bloqueantes de ácidos se prescriben a menudo. Siete bebés con cólicos estaban tomando lansoprazol, 1 tomaba ranitidina y 1 tomaba ambas.

Los autores examinaron si estos medicamentos podrían haber influido en los resultados y volvieron a analizar los datos excluyendo a estos 9 lactantes. Los resultados para tiempo de llanto + molestia, calprotectina fecal, y diversidad microbiana beta se mantuvo sin cambios, con idénticas conclusiones.

Los autores utilizaron el Análisis Aleatorio de Forester para determinar los factores más importantes, además del tiempo de llanto + molestia para clasificar a los bebés en controles en comparación con aquellos con cólicos.

Considerando la microbiota fecal, el tipo de alimentación, la edad, el uso de bloqueantes de ácido, y la calprotectina fecal, encontraron que, con mucho, la variable más importante fue la calprotectina fecal, siendo la edad y la presencia de Acinetobacter la segunda y la tercera variable más importantes, respectivamente.

Discusión

"El sonido de un bebé llorando. . . es casi el ruido más inquietante, exigente y demoledor que podemos escuchar". 18

Los cólicos se han atribuido a una serie de causas distintas a la inflamación intestinal, como el estrés durante el embarazo y las experiencias negativas durante el parto, 19 alergia a las proteínas de la leche, 20 y a la necesidad del bebé de estar meses adicionales de crianza en un ambiente similar a un útero. 21

Sin embargo, en el artículo de referencia que describe el cólico en 1954, Wessel y colaboradores apuntan claramente hacia el tracto gastrointestinal, citando el dolor causado por “proteoides excesivos como los del frijol que se someten rápidamente a la descomposición gaseosa... lo que causa peristalsis violenta.”1 También señaló que “los enemas pueden disminuir la fermentación putrefactiva” en esta condición.

Olafsdottir y colaboradores compararon la calprotectina fecal en heces de bebés normales con la de bebés con cólicos.9 Ellos informaron que no había diferencias en la calprotectina fecal en los 2 grupos, notando niveles muy altos en todos los bebés.9

Los autores de este estudio y otros han informado disminuciones longitudinales en la calprotectina a medida que el cólico se resuelve, 11,22,23 pero no se estableció una asociación entre la calprotectina y el cólico. Un problema es que la fuente de la leche puede influir en la calprotectina.

Si la alimentación con fórmula se asocia o no una disminución del nivel de calprotectina fecal en comparación con la leche materna ha sido un punto de debate.14,24-26

Los resultados de los autores muestran claramente que el nivel de calprotectina está asociado a la presencia o ausencia de cólicos, independientemente de la fuente de la leche. Savino y colaboradores confirmaron un mayor nivel de calprotectina en bebés con cólicos.27

El apoyo adicional para la inflamación en bebés con cólicos proviene de Partty y colaboradores, que mostraron inflamación sistémica de bajo grado en estos bebés, basada en los niveles circulantes de interleucina-8, factor inhibidor de macrófagos 1-β y péptido quimiotáctico de monocitos-1.28

La disbiosis generalmente se refiere a una diferencia en la composición de la comunidad microbiana cuando se compara un grupo enfermo con controles sanos. La composición microbiana de las heces puede ser programada por la maduración postnatal, medicamentos, opciones dietéticas, antibióticos, características del estilo de vida y estrés psicológico.29

La colonización diferencial de un intestino relativamente estéril con bacterias antiinflamatorias (Bifidobacterias) o los taxones proinflamatorios (Proteobacterias) pueden subyacer en la inflamación del intestino observada en el recién nacido. Se han encontrado diferencias en la diversidad beta en 2 estudios prospectivos de enterocolitis necrotizante en lactantes prematuros.30,31

Savino y colaboradores investigaron si el cólico podía estar relacionado con la disbiosis intestinal y encontraron una reducción de lactobacilos y un aumento de Escherichia coli en bebés con cólicos utilizando reacción en cadena de polimerasa. 7,32

Posteriormente, las observaciones de los autores (utilizando electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante) mostraron un aumento en la Klebsiella fecal en el 50% de los bebés con cólicos, en comparación con el 6% de los lactantes control.6

En un estudio que usó secuenciación 16S rADN microbiana, De Weerth encontró una reducción de Bifidobacterias, Lactobacilli, y Bacteroidetes en forma concomitante con el incremento de Proteobacterias en bebés con cólicos.5

Otro grupo tomó las heces de 14 bebés, 7 con cólicos, e infundieron un “trasplante fecal” en ratones, para medir la hipersensibilidad visceral a la distensión colorrectal mediante electromiografía de los músculos abdominales. 33

Los autores pudieron demostrar que las heces de los bebés con el mayor tiempo de llanto produjo los mayores cambios en la electromiografía, lo que indica una hipersensibilidad visceral, claramente relacionada a Bacteroides vulgatus y Bilophila wadsworthia.

En el presente estudio, los autores encontraron menor diversidad microbiana en los lactantes amamantados que en los lactantes alimentados con leche de fórmula, de forma similar a informes anteriores, 34,35 pero no se observaron grandes diferencias en la diversidad alfa atribuibles a los cólicos.

Encontraron una diferencia significativa en la composición de la comunidad en bebés con cólicos. Se predeciría que los Bifidobacilos antiinflamatorios reducidos se asociarían con aumento de la inflamación; y los niveles reducidos se han relacionado recientemente con el estrés materno prenatal.36

Anteriormente, ninguna de las especies identificadas como un potencial patobionte en el presente estudio se ha vinculado a los cólicos. L iners es miembro de la flora vaginal que se ha asociado con vaginosis bacteriana; produce una toxina relacionada con un resultado adverso del embarazo.37,38 El Acinetobacter  también es un organismo vaginal y un patógeno oportunista, que se ha asociado con la sepsis.39

Una debilidad del estudio es el número relativamente pequeño de niños reclutados. Los autores inscribieron a todos los bebés atendidos en sus consultorios de pediatría general o derivados de clínicas privadas colaboradoras cuyos padres estuvieron dispuestos a participar.

Encontraron que algunos padres eran reacios a llenar los diarios Barr, particularmente en el grupo de control, y otros estaban demasiado estresados u ocupados para participar.

El rango de edad de 37-82 días en los controles y de 34-60 días en aquellos con cólicos estaba superpuesto. La diferencia en el valor medio de 3 semanas (estadísticamente no significativo) no se predice que tenga un impacto en cualquiera de las 2 variables de resultado principales, calprotectina fecal o microbiota.

El nivel de calprotectina fecal no muestra ninguna tendencia en el rango de edad de 34-82 días. Li y colaboradores demostraron que hay una disminución en la calprotectina fecal, al comparar a los niños de 3 a 6 meses con los de 1 a 3 meses, pero ese es un rango de edad mucho mayor, en un momento durante el cual se está produciendo el destete y se están introduciendo alimentos sólidos.12

La diferencia en la microbiota fecal durante este período de 3 meses tampoco es probable que sea significativa. Anteriormente los autores estudiaron heces secuenciales a 4 intervalos durante este marco de tiempo (en 2 ensayos controlados aleatorios).

Hay una composición caótica de la microbiota durante este período de tiempo; y fueron incapaces de detectar una evolución de un "núcleo" de microbiota durante los primeros 90 días. Esto es particularmente evidente en los datos agrupados y en los datos individuales en su estudio de bebés con cólicos alimentados con fórmula. 11

Otras debilidades de este estudio incluyen que no analizaron los niveles de metabolitos fecales para identificar si productos bacterianos particulares podrían estar asociados con los cólicos.

Baldassarre y colaboradores encontraron que una cantidad de metabolitos fecales aumentaron más en bebés con cólicos que tomaron un placebo que en pacientes que respondieron a un probiótico de 8 organismos.40

Los metabolitos posiblemente relacionados con el cólico en su análisis incluyeron 2-hidroxi isovalerato, alanina y 2-oxo-isocaproato. Finalmente, la endoscopia superior o la colonoscopia podría haber sido útil para identificar un sitio de inflamación, pero esto habría requerido anestesia general y es probable que haya sido rechazado por la junta de revisión interna.

En resumen, los resultados de los autores apoyan firmemente la teoría de la disbiosis inflamatoria para el cólico infantil e indican que la fuente de la leche no sesga estos hallazgos. Estos resultados pueden proporcionar un marco conceptual para dar cuenta de los efectos beneficiosos del probiótico L reuteri en lactantes con cólicos.41-43

Comentario

El presente estudio describe que la calprotectina fecal estaba elevada en los bebes con cólicos, tanto en los alimentados con leche materna, leche de fórmula o con ambas.

Los autores asocian los cólicos del lactante con la inflamación intestinal y la disbiosis, con menor cantidad de Bifidobacilli

Serán necesario más estudios con mayor número de pacientes para sustentar estos hallazgos.

Resumen y comentario objetivo: Dra. Alejandra Coarasa

 

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