Cólicos infantiles, inflamación intestinal y disbiosis

El cólico infantil, definido como 3 horas de llanto + molestia durante más de 3 días por semana en un bebé <3 meses, afecta al 10%-15% de la población infantil normal.¹

Prácticamente todas las revisiones concluyen que no existe una etiología establecida para los cólicos, aunque se postularon la alergia a la leche, el reflujo esofágico, la migraña, los déficits en el procesamiento sensorial y las dificultades para una lactancia efectiva.^2-4

Varios grupos de investigación encontraron previamente evidencia de disbiosis, o una comunidad microbiana intestinal anormal en estos bebés.^5-7 La disbiosis se ha asociado con una variedad de enfermedades gastrointestinales humanas, como el síndrome del intestino irritable y la enfermedad inflamatoria intestinal.⁸

Los autores sugirieron que las alteraciones microbianas en los cólicos se asocian con la inflamación intestinal, medida por la calprotectina fecal, una proteína antimicrobiana liberada a partir de neutrófilos entéricos utilizados para la valoración de la inflamación intestinal. Sin embargo, estudios anteriores han mostrado niveles similares de calprotectina fecal en lactantes con y sin cólicos.⁹

Las mediciones secuenciales de calprotectina en bebés con cólicos han mostrado consistentemente una reducción a medida que mejoraba el llanto, ^10,11 pero algunos han sugerido que este es un fenómeno normal del desarrollo.^12,13

Uno de los factores de confusión en la hipótesis de la inflamación intestinal-disbiosis para el cólico es que los bebés que reciben leche materna pueden tener niveles más altos de calprotectina fecal que los alimentados con fórmula, ¹⁴ aunque esto no se ha encontrado de manera consistente.¹³

Anteriormente los autores informaron que los niveles de calprotectina en la leche materna representaban aproximadamente el 1% de los niveles fecales.¹⁵

Los bebés que toman leche materna pueden tener una población microbiana diferente con una diversidad alfa (número de especies) en comparación con las de las fórmulas para lactantes, lo que complica las conclusiones sobre la diversidad cólica y microbiana.¹⁶

En el informe actual, los autores abordaron 2 preguntas: ¿Se relacionan los cólicos con la inflamación intestinal y la disbiosis? O, alternativamente, ¿los niveles elevados de calprotectina y la microbiota anormal son artefactos producidos por los efectos del tipo de leche y un microbioma neonatal desarrollado de forma incompleta?

Este estudio anidado de casos y controles de lactantes (de 21 a 90 días de edad) incluyó lactantes enrolados en 2 ensayos previos de los autores aleatorios, doble ciego, controlados con placebo^6,11 o enrolados como controles pareados por edad que no lloraron > 3 horas / día.

Todas las muestras fueron procesadas y analizadas de forma idéntica al inicio del estudio antes de recibir el producto del estudio (probiótico o placebo) en ambos ensayos. Todos los autores tuvieron acceso a los datos del estudio y revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Evaluaron el llanto mediante una técnica validada, el diario Barr, ^6,17 y requirieron demostración de un promedio mayor de 3 horas de llanto y molestia (no consecutivo) durante 2 de 3 días.

Los estudios fueron aprobados por el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en la Junta de Revisión Institucional de Houston (HSC-MS-10-0048 y HSC-MS-11-0203) y registrado en ERA Commons (Clinicaltrials.gov: NCT01279265 y NCT01849991).

El reclutamiento se realizó a través de los consultorios locales de pediatras y de las clínicas de la Universidad de Texas-Houston. La publicidad fue a través de correos, cobertura de medios y un sitio web. Los padres de los bebés que no tenían cólicos también proporcionaron un diario de Barr.

Los autores excluyeron a los bebés con <32 semanas de gestación, falta de crecimiento, enfermedad pulmonar, diarrea, fiebre o consumo previo de un probiótico o antibiótico. Los bebés amamantados fueron suplementados con vitamina D, sin otros suplementos.

Las pruebas de detección incluyeron 65 individuos, 37 con cólicos y 28 sin cólicos. Los evaluadores de muestras y datos se cegaron al proceso y al análisis para cada individuo. Todas las muestras de heces fueron procesadas para análisis de microbiota fecal; 13 fueron excluidos del análisis de calprotectina fecal debido a una cantidad inadecuada para las pruebas.

> Análisis microbiano de heces

Los padres recolectaron una muestra de heces dentro de las 48 horas de la consulta. Las muestras fueron subdivididas y almacenadas a -80° C. Se extrajo el ADN utilizando el Mini Kit de ADN de Heces QIAamp (Qiagen, Valencia, California).

La secuenciación de ADN fue realizada por el Grupo de Recursos de Genómica Microbiana de la Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Louisiana.

La región hipervariable V4 de 16S rADN fue amplificada por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores específicos de genes con adaptadores Illumina: 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA y 805R GGACTACHVGGGTWTCTAA.

Se realizó la identificación taxonómica y el análisis de las secuencias del gen V4 16S rRNA utilizando QIIME (http://qiime.org) y R (R versión 3.4.3) con las bibliotecas Phyloseq (v1.22.3; https://github.com/joey711/ phyloseq) y Tidyverse (v1.2.1; https://www.tidyverse.org/contribute). Cabe señalar que, aunque las heces se recolectaron al inicio de diferentes estudios, se secuenciaron de la misma manera.

> Calprotectina fecal

Las heces fueron procesadas y analizadas de acuerdo con el protocolo del fabricante por medio del kit de la prueba ligada a enzimas inmunoabsorbente de calprotectina fecal. El nivel de calprotectina se expresó como µg/g de peso de las heces. Los ensayos se realizaron con el mismo kit (Eagle Biosciences, Nashua, New Hampshire), un ensayo con alta reproducibilidad para heces congeladas.^11,15

> Análisis estadístico

Las características de los pacientes se compararon utilizando la prueba t de 2 muestras cuando se distribuyen normalmente (las variables se informaron como media ± DE) o utilizando la prueba de la suma de rangos de Wilcoxon si las variables no se distribuyeron normalmente (se informaron como medianas con RIC).

La correlación de la calprotectina fecal y el tiempo de llanto + molestia fue realizada ajustando un modelo de regresión lineal a los datos normalizados y fue reportada utilizando un coeficiente de correlación de Pearson. Se utilizaron correlaciones de Spearman para describir relaciones entre variables continuas no distribuidas normalmente.

Se determinaron diferencias en la composición microbiana entre grupos de las muestras utilizando métricas múltiples, incluyendo diversidad alfa por el número de especies observadas y los índices de diversidad de Shannon  y Simpson.

La diversidad beta fue evaluada utilizando el análisis no paramétrico de la varianza molecular implementado en el paquete Vegan R (v2.4.5).

La abundancia de taxones fue comparada con las pruebas de suma de rangos de Wilcoxon para la comparación por pares y las pruebas de suma de rangos de Kruskal-Wallace para las comparaciones implicando >2 grupos. La corrección de Benjamin-Hochberg fue utilizada para controlar para múltiples pruebas.

Los modelos de clasificación aleatorios de Forest incluyeron la unidad taxonómica operacional relativa (UTO), edad, uso de bloqueadores de ácido, calprotectina fecal, y tipo de alimentación utilizando el paquete aleatorio Forest R y 20000 formas y 9 variables en cada división.

También se realizó un subanálisis para casos y controles emparejados por edad (±5 días). Los niveles de calprotectina fecal se compararon entre los pares emparejados utilizando una prueba de rangos con signo de Wilcoxon. La significancia estadística se asumió con una tasa de error tipo 1 del 5%.

Las características basales de los bebés elegibles para el análisis de microbiota fecal no demostraron diferencia significativa entre los grupos con cólicos y los grupos normales en términos de edad gestacional, edad, sexo, raza y etnicidad, aunque hubo una tendencia hacia más bebés caucásicos en el grupo cólico.

Todos los niños fueron a término o prematuros tardíos y de aproximadamente 2 meses de edad al momento de la inscripción.

El tiempo de llanto + molestia fue de aproximadamente 5 horas en el grupo con cólicos y <1 hora en el grupo control.

> Calprotectina fecal en bebés con cólicos

Para probar la inflamación intestinal, los autores analizaron los niveles de calprotectina fecal en función de los cólicos. En el análisis univariable, los niveles de calprotectina fueron 7 veces más altos entre los lactantes amamantados (mediana, 183; RIC, 234) en comparación con los bebés alimentados con fórmula (mediana, 23,7; RIC, 97,7) o lactantes alimentados con leche de fórmula + leche materna (mediana, 107; RIC, 109) (P = 0,031).

Sin embargo, los modelos multivariables ajustados tanto para cólico como para alimentación demostraron una asociación independiente de la calprotectina con los cólicos (p <0,001), pero no con la fuente de la leche.

Debido a que el llanto + el tiempo de molestia fue el factor determinante para la clasificación de los cólicos, también se asoció con la calprotectina fecal en modelos de correlación o regresión univariables. Sin embargo, cuando se estratificó por estado del cólico, no hubo correlación significativa entre el llanto + el tiempo de molestia y los niveles de calprotectina.

Aunque la edad tampoco se asoció con el nivel de calprotectina en los modelos de los autores, se realizó un subanálisis para confirmar que la pequeña diferencia de edad estadísticamente no significativa entre los casos y los controles no estaba confundiendo los resultados.

Realizando la correspondencia de casos y controles por edad (± 5 días) se dio lugar a 13 pares emparejados, incluidos 8 pares (62%) que tenían una diferencia de edad dentro de un rango ± 1 día. Los niveles de calprotectina fueron mayores en los casos en comparación con sus controles pareados por edad (diferencia de mediana, 204,9 µg/g de heces); rango, -349,1 a 1002,1; P=0,016).

Los modelos multivariables no pareados de raíz cuadrada transformaron los niveles de calprotectina, ajustando por los efectos independientes del estado del cólico, el tipo de alimentación, el tiempo de llanto + molestia y la edad, y los efectos interactivos del tipo de cólico y de alimentación, dando como resultado al cólico como el único predictor independiente de los niveles de calprotectina fecal (β=9,74; intervalo de confianza 95%, 2,96-16,53). Eso se traduce en niveles de calprotectina que fueron 95 µg/g más altos en los bebés con cólicos que en los bebés sin cólicos.

> Composición microbiana fecal en bebés con cólicos

• Diversidad alfa. Los autores encontraron que la riqueza intestinal bacteriana alfa medida por el número de especies, fue significativamente mayor en muestras de cólicos que en los controles (P=0,025); sin embargo, ambos índices de diversidad de Shannon y Simpson no fueron significativamente diferentes en los bebés con cólicos en comparación con los controles.

Sin embargo, la diversidad alfa se vio afectada significativamente por el modo de alimentación, con la mayor diversidad en los bebés alimentados exclusivamente con fórmula y la más baja en los controles amamantados (Shannon, P=0,.0001; Simpson, P=0,0004).

• Microbiota. Los autores notaron que las muestras de heces tenían muy alta variabilidad de muestra a muestra, lo que ya habían reportado previamente, ¹¹ probablemente debido a la naturaleza de la microbioma neonatal. Examinaron el 99,99% de las UTOs más abundantes, lo que redujo sus datos a 5 filos: Actinobacterias, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacterias y Verrucomicrobia.