Rinovirus humano y sibilancias

Las infecciones del tracto respiratorio se producen con frecuencia en la infancia y se cree que los virus  son responsables de una parte importante de la morbi-mortalidad respiratoria en este grupo. Hasta un 85 a 90%  de los patógenos respiratorios pueden ser detectados en los niños con enfermedad de las vías respiratorias. También en niños asintomáticos se puede descubrir una alta prevalencia de patógenos respiratorios. El Rinovirus Humano (RVH) es el virus más frecuentemente encontrado en niños asintomáticos, pero también en niños con enfermedad del tracto respiratorio inferior grave.

Un número de estudios prospectivos de cohortes de alto riesgo mostró que las enfermedades virales con sibilancias, especialmente las causadas por RVH, son los indicadores más importantes del desarrollo posterior de sibilancias o asma en la infancia. Por otro lado, se ha sugerido que las infecciones asintomáticas por RVH no están asociadas con sibilancias posteriores. Hasta ahora, no está claro si el RVH asociado a sibilancias es simplemente un indicador de la susceptibilidad a la enfermedad. Esta cuestión requiere estudios en grupos que no sean de alto riesgo y una vigilancia exhaustiva de la aparición de infecciones virales en niños con y sin síntomas respiratorios.

Los estudios sobre una posible relación entre el RVH y los trastornos sibilantes también deben tener en cuenta los factores que posiblemente influyen en la relación entre el RVH y la enfermedad respiratoria. Los factores del huésped, como la edad, la prematuridad, el tamaño de los pulmones y la predisposición genética, se sugieren como una posible influencia en el impacto de los virus en la salud de la infancia y, posiblemente, influyen en los demás. Las co-infecciones con múltiples  virus también se mencionan como un factor de riesgo para las enfermedades respiratorias, aunque los informes no son concluyentes al respecto. Además, los factores ambientales, como la asistencia a la guardería, el antecedente de sibilancias y  tener padres fumadores, pueden influir en la relación entre el virus y la enfermedad respiratoria.

Anteriormente se demostró en lactantes sin alto riesgo que la alta resistencia del sistema respiratorio (Rsr) poco después de nacer es un factor de riesgo claro para RVH asociado a sibilancias. Se desconoce si la función pulmonar previa a los síntomas también contribuye a si estos niños desarrollaran o no síntomas respiratorios en la edad adulta. En este estudio previo, los autores no han podido localizar virus respiratorios en forma regular, durante ambos períodos sintomático y asintomático. Tal enfoque es un requisito previo para estudiar la relación entre la infección por RVH y los síntomas durante la infección presente y en la edad adulta.
A fin de evaluar el papel de las infecciones por RVH durante la infancia en el desarrollo de las enfermedades respiratorias durante la infancia y la niñez, se realizó un nuevo estudio en el que se realizaron pruebas exhaustivas en busca de virus respiratorios en forma regular, independientemente de los síntomas respiratorios. En un grupo no selectivo de niños, se registraron los síntomas respiratorios durante los primeros 4 años de vida, junto con las posibles influencias del huésped  y factores ambientales.

Materiales y métodos

Diseño y sujetos del estudio
Todos los niños con sibilancias eran participantes del Estudio de Enfermedades Sibilantes Leidsche Rijn (WHISTLER), un estudio de cohorte prospectivo basado en población sobre factores determinantes de las enfermedades con sibilancias, incluyendo la función pulmonar en los primeros años de vida, que comenzó en diciembre de 2001. En el WHISTLER 2, se realizaron sub-estudios virológicos.

Para el primer estudio, se les pidió a los padres recolectar hisopados virales cuando sus hijos experimentaran síntomas respiratorios durante el primer año de vida. Entre abril de 2006 y julio de 2007 se seleccionó un nuevo grupo de padres al azar para participar en el segundo estudio virológico y para recoger muestras virales cada mes durante el primer año de vida del niño, independientemente de los síntomas.

El diseño del WHISTLER se ha descrito en otra parte. En pocas palabras, los niños sanos se inscribieron en este estudio a la edad de 2-3 semanas, antes de que se hubieran producido síntomas respiratorios. Los criterios de exclusión fueron: edad gestacional <36 semanas, anomalías congénitas mayores y enfermedades respiratorias neonatales. Al inicio del estudio, se utilizó un cuestionario a completar por la madre para obtener información sobre la edad gestacional, la talla y el peso al nacer, los hermanos, las mascotas y la exposición al humo de tabaco. Si un niño experimentaba dermatitis atópica durante el primer año de vida fue reportado por los padres en una encuesta mensual. Los datos sobre asma parental fueron obtenidos a partir de un cuestionario aplicado a los padres. La función pulmonar se midió antes de los 2 meses de edad durante el sueño natural y sin el uso de ninguna sedación. La función pulmonar se evaluó a partir de la medición de la mecánica respiratoria pasiva (resistencia [Rrs] y compliance [Crs] total del sistema respiratorio) usando la técnica simple de oclusión de respiración. El estudio fue aprobado por el comité local de ética médica (Centro Médico de la Universidad de Utrecht), y todos los padres dieron su consentimiento informado.

Muestreo y análisis viral
Al inicio de cada mes se recogieron hisopados de la nariz y la garganta para análisis de virus, independientemente de los síntomas respiratorios. Las muestras fueron tomadas por los padres con un bastoncillo de algodón, tanto de la nariz como de la orofaringe posterior. Ambos hisopos se recogieron en un único vial con medio de transporte viral (gelatina, hidrolizado de lactoalbúmina, medio de levadura que contiene 0,1 mg/ml pimaricina) y se enviaron al laboratorio por correo regular. A su llegada, las muestras se almacenaron a -20° C hasta su análisis. El muestreo de los patógenos respiratorios realizado por los padres a través de hisopados de la nariz y la garganta demostró ser factible y confiable. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó en el Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente, Bilthoven, Países Bajos. La PCR en tiempo real (RT-PCR) para RVH y enterovirus se realizó como se describió inicialmente por Andeweg y colaboradores, con algunas modificaciones. El  ARN viral fue extraído a partir de 200 µL de medio de transporte mediante el uso del kit de aislamiento de ARN Alto Puro  (Boehringer, Ingelheim am Rhein, Alemania). Cinco microlitros de la preparación de ARN eluído se utilizó a continuación en una reacción de 45 µL de la reacción RT-PCR.

Las condiciones de RT-PCR fueron 50 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 50 mM de NaCl, 6 mM de MgCl2, 2 mM de ditiotreitol, desoxinucleósidos trifosfato (1 mM cada uno), 2,5 unidades de inhibidor de ARNasa (Amersham Life Science, Buckinghamshire, Inglaterra), 15 unidades de transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (Boehringer), 2,5 unidades de Taq polimerasa (Perkin-Elmer, Waltham, MA) y 0,5 mM de cebador RE21A 5'-CGG TAA YTT TGT ACG CCA GTT-3 ' y Primer re22 5'-CGG ACA ACA CCC AAA GTA-3 '. Después de la reacción de RT (0,5 horas a 50° C), la 5 'NCR se amplificó por 1 ciclo a 94° C durante 3 minutos, a 50° C durante 1 minuto y a 72° C durante 2 minutos, seguido de 19 a 20 ciclos a 95° C durante 15 segundos, a 50° C durante 1 minuto y a 72° C durante 2 minutos.

La amplificación secundaria se realizó en 1,5 µLl del producto de RT-PCR, con la misma mezcla de PCR como se describe para la primera RT-PCR, a excepción de la transcriptasa reversa del virus de la mieloblastosis aviar y enzimas fuera de ARNasa, en un volumen final de 46,5 µL con cebadores RE23 5'-CAA GCA CTT CTG TTT CCC CGG-3 'y 5'-RE24 CAT TCA GGG GCC GGA GGA-3' 1 ciclo a 94º C durante 3 minutos, a 64° C durante 1 minuto y a 72° C durante 2 minutos, seguido de 39 ciclos a 95° C durante 15 segundos, a 64° C durante 1 minuto y a 72° C durante 2 minutos. Los productos de PCR se analizaron en gel de agarosa al 1%, juzgados por la presencia de alrededor de 270 pb de amplificación de PCR y se hibridó con una sonda marcada con biotina específica de rinovirus humano, PrRHi 5'-AG C CTG CGT GGC TGC C-3’. A partir de los amplicones de las muestras negativas y positivas de  hibridación de PCR, la amplificación de 5'NCR se secuenció para la determinación final del virus. La PCR para metapneumovirus humano (hMPV), coronavirus humano 229E, Chlamydia pneumoniae y Mycoplasma pneumoniae fueron analizados por PCR convencional. La RT-PCR para coronavirus humano OC43 se realizó utilizando el formato LightCycler 2.0 con Taqman Mastermix LightCycler (Roche, Alemania). Un paso de transcripción inversa con el virus de la mieloblastosis aviar se utilizó durante 60 minutos a 42° C. La reacción consistió de 1 ciclo de 10 minutos a 95° C y 45 ciclos de 10 segundos a 95° C, de 30 segundos a 60° C y 15 segundos a 72° C, con cebadores OC43 241F 5'-GGA CTA TCA TAC YCT GAC GG-3 'y OC43-310R 5'-AAT CTG AAG AAT AG MCP C CA-3' y la sonda OC43-271P-5'-AG YakimaYellow TGCTTTGGTCCTCGTG-BHQ1-3 dirigidas a la glicoproteína de membrana.

La PCR para la detección de adenovirus se realizó por PCR convencional (PE 9700) y se analizó por electroforesis en gel. La RT-PCR para el coronavirus humano NL63, virus influenza A y B, virus sincicial respiratorio A y B se realizó mediante el formato LightCycler 2.0 con LightCycler TaqMan Mastermix. Todas las muestras se ensayaron a posteriori por RT-PCR para bocavirus humanos y los poliomavirus WU (WUPyV) y KI (KIPyV). La amplificación se llevó a cabo en una mezcla de reacción de 25 µL en una reacción mixta en un Fast RT-PCR System 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Los virus parainfluenza 1-4 se determinaron con un paso RT-PCR 2, que se realizó como un múltiplex de los 4 conjuntos de primers. Se generó ADNc, usando hexámeros aleatorios (2,5 ng / µL) con 5U de transcriptasa reversa del virus de la mieloblastosis aviar (Promega, Fitchburg, WI) durante 1 hora a 42°C.

Síntomas respiratorios
Los síntomas respiratorios durante el primer año de vida se registraron mediante un cuestionario  prospectivo completado por los padres en forma diaria. Los síntomas respiratorios considerados fueron la tos y las sibilancias (un silbido procedente del pecho y no de la nariz) con o sin fiebre (temperatura por encima de 38° C). Los niños con 1 de estos síntomas se consideraron "sintomáticos", los niños sin tos o sibilancias se consideraron “asintomáticos". Los padres fueron instruidos por los médicos investigadores para reconocer los síntomas de tos y sibilancias al inicio del estudio. Posteriormente, los datos de estos cuestionarios se fusionaron con los datos de las muestras para determinar si se recogieron muestras durante los episodios sintomáticos o asintomáticos. Las muestras se consideraron sintomáticas cuando los síntomas respiratorios estuvieron presentes durante un período de más de 2 días, incluyendo el día del muestreo.

Los datos sobre las visitas de atención primaria y las prescripciones se obtuvieron de los archivos electrónicos de los médicos generalistas durante los primeros 4 años de vida. Las sibilancias diagnosticadas por el médico se evaluaron mediante el uso de diferentes categorías de enfermedades con sibilancias en la atención primaria, de acuerdo con la Clasificación Internacional de Enfermedades Primarias. Los medicamentos se clasificaron de acuerdo con la clasificación Química Terapéutica Anatómica. Las sibilancias a los 4 años se definieron como al menos una visita al médico o una prescripción de medicamentos para las sibilancias en el cuarto año de vida. Sólo los niños con al menos 6 hisopados y 48 meses de seguimiento se tomaron en cuenta para el estudio de seguimiento.

Análisis estadístico
A fin de tener en cuenta la naturaleza dependiente del episodio síntoma respiratorio para un paciente individual, se utilizó un modelo de regresión logística de efectos mixtos, con un efecto aleatorio
para los pacientes y efectos fijos para el resto de las variables. El resultado se definió como síntomas respiratorios durante más de 2 días (sí o no) durante un episodio de virus incluidos en la muestra. En primer lugar, se utilizó el análisis univariado para investigar la influencia de los factores determinantes por separado. A continuación, se utilizó el análisis multivariado para evaluar la independencia de los factores asociados. Los resultados se presentan como odds ratio (OR) con un intervalo de confianza del 95% (IC). Los IC 95% no incluyendo 1 se consideraron estadísticamente significativos. En los análisis exploratorios sobre las diferencias en la prevalencia del virus entre los episodios sintomáticos y asintomáticos, se ignoraron las hipótesis de independencia, y la prueba de chi-cuadrado se utilizó para comparaciones de grupos.

Para las asociaciones entre los agentes patógenos respiratorios durante la infancia y las enfermedades sibilantes durante la infancia a los 4 años de edad, se utilizó análisis de regresión logística. En primer lugar, el análisis se ajustó por sexo, ya que el sexo masculino se asocia con sibilancias durante la infancia y la niñez. En segundo lugar, además, se ajustó por Rrs o Crs, dado que se describe la menor función pulmonar asociada con sibilancias durante la infancia y la niñez. Otro posible factor de confusión que podría estar relacionado con la función pulmonar neonatal y sibilancias virales en la infancia y la niñez es la edad gestacional y el peso de nacimiento. Como otros estudios describen las medidas de atopia como sibilancias asociadas con RVH y sibilancias después en la vida, la dermatitis atópica también se ve como un posible factor de confusión. A medida que el número de resultado no fue suficiente para incluir todas estas variables al mismo tiempo, se ajustó por separado para Rrs o Crs y la edad gestacional, el peso al nacer o la dermatitis atópica en el primer año de vida. El análisis también se llevó a cabo después de la estratificación para la dermatitis atópica. Las comparaciones de grupo y el análisis de regresión logística se realizaron con SPSS (versión 15.0, SPSS Inc., 2007, Chicago, IL). El análisis de efectos mixtos se realizó con el programa estadístico R (paquete 2.12.2, http://www.R-project.org/).

Resultados

Población de estudio
En total, 386 niños fueron incluidos en el estudio WHISTLER entre abril de 2006 y  julio de 2007. Ciento sesenta y seis niños fueron invitados a participar en la parte virológica del estudio. Veintiséis niños se perdieron durante el seguimiento después de la primera visita de inclusión (fracaso del éxito en la medición de la función pulmonar en 13 y negativa de los padres en otros 13). Los 140 niños restantes fueron representativos de todo el grupo de estudio y tuvieron una media de seguimiento en base al cuestionario de los problemas respiratorios de 10,3 meses (86% de seguimiento). Estos lactantes informaron una mediana de 5 episodios de enfermedad respiratoria por niño/año (rango 0-18). Noventa y seis niños tuvieron seguimiento completo hasta la edad de 4 años (22 desplazados durante los primeros 4 años de vida y sin historia completa del paciente, los padres de 22 niños recogieron menos de 6 hisopados).

En total se recogieron 1.425 muestras, 245 asintomáticas y 1180 sintomáticas. Fueron realizados un total de 18.525 informes de PCR virales. Una proporción sustancialmente mayor de patógenos se encontró en los episodios sintomáticos (85,3%) en comparación con los asintomáticos (51,1%, P <0,01). El HRV fue el patógeno más frecuente, tanto en los episodios sintomáticos (62,4%) como asintomáticos (36,2%, P <0,01).

Múltiples patógenos se detectaron significativamente más a menudo en los episodios sintomáticos (33,5%) en comparación con los asintomáticos (14,7%, P <0,01). La distribución de frecuencia de los virus durante los períodos sintomáticos y asintomáticos no fue sustancialmente diferente al estudiar exclusivamente la infección por el virus solo.