Desarrollo y características específicas | 06 MAY 13

Microbiota intestinal de lactantes con cólicos

Seguimiento del desarrollo de la microbiota intestinal en lactantes con y sin cólicos
Autor/a: Dres. Carolina de Weerth, Susana Fuentes, Philippe Puylaert and Willem M. de Vos Pediatrics 2013; 131; e550

El cólico del lactante, también referido como un llanto excesivo, afecta a muchos niños. Mediante los criterios Wessel modificados ampliamente utilizados para definir al cólico (por ejemplo, llanto durante un promedio de > 3 horas por día), St James-Roberts reportó tasas de prevalencia que varían del 6,4% al 29% entre los 0 y 3 meses de edad. Los cólicos causan mucha preocupación y angustia en los padres, que buscan ayuda profesional en 1 de cada 6 casos.

La patogénesis del cólico infantil no es bien comprendida, y las causas subyacentes de los cólicos siguen sin explicación.  Incluso se ha propuesto que, a pesar del nombre, el cólico puede no tener un origen intestinal aunque refleja el extremo final de la distribución normal del llanto infantil. Está en uso una variedad de tratamientos físicos, dietarios, o medicamentosos, pero su eficacia es difícil de evaluar debido a que el llanto excesivo mayormente se detiene aproximadamente a los 4 meses de edad. Por otra parte, un examen reciente indicó que la evidencia clínica para la eficacia de estos tratamientos es generalmente muy baja o moderada.

Se ha propuesto que diversas aberraciones en la microbiota intestinal del lactante podrían afectar la función motora intestinal y la producción de gas, que a su vez conducen a la producción de dolor abdominal y de cólicos. Algunos estudios indicaron que la microbiota intestinal en lactantes con cólicos difería de la de los niños controles sanos. Por ejemplo, los lactantes con cólicos mostraron una microbiota fecal menos diversa, que se asocia con aumento de los niveles de calprotectina que son indicativos de inflamación intestinal.

Por otra parte, se halló que los niños con cólicos tenían recuentos más bajos de lactobacilos y un mayor número de bacterias Gram-negativas en sus heces. Sin embargo, estos informes describieron diferencias en los recién nacidos ya diagnosticados con cólicos y que tenían por lo general > 6 semanas de edad. También, con una excepción, se basaron en enfoques tradicionales de cultivo que no representan la complejidad de la microbiota intestinal. El reciente desarrollo de enfoques de alto rendimiento y moleculares permite una visión de la microbiota intestinal y de su función en la que el sesgo es en gran medida reducido. La aplicación de estos métodos moleculares ha demostrado que el tracto intestinal es colonizado rápidamente en los primeros años de vida por una comunidad microbiana en desarrollo que muestra patrones de sucesión específicos.

Mientras que al nacer el tracto intestinal es prácticamente estéril, ya dentro de unas pocas horas, las bacterias comienzan a aparecer en las muestras de heces. Estos primeros pobladores son a menudo bacterias anaerobias facultativas que son rápidamente reemplazadas por anaerobios con disminución de los niveles de tolerancia al oxígeno. Después de varios años de vida, se establece un complejo ecosistema microbiano, que se asemeja al de los adultos.

Aunque todavía no se conoce el orden exacto y el impacto de esta sucesión microbiana, se puede prever que las desviaciones en el proceso de colonización intestinal temprana podrían tener un impacto en la vida posterior. Estas desviaciones podrían aplicarse también a la etiología del cólico del lactante. Si es así, estas desviaciones deberían aparecer temprano en la vida, precediendo al llanto excesivo que se sabe tiene su pico aproximadamente a las 6 semanas.

El actual estudio se inició para seguir prospectivamente el desarrollo temporal de la microbiota intestinal en un grupo de niños con y sin cólicos. Se recogieron muestras en el primer mes después del nacimiento, que precede al pico de cólicos a las 6 semanas de edad, y de nuevo a los 3 a 4 meses de edad. Al considerar los primeros 100 días de vida, los autores observaron el desarrollo del fenotipo cólico, así como el período de seguimiento, cuando el cólico tenía más probabilidades de haber resuelto.

En contraste con estudios anteriores que se centraron en bacterias específicas y a menudo cultivadas, los autores abordaron aquí la composición total de la microbiota intestinal por extracción del ADN fecal y su análisis con una micromatriz (conocida como microarray) filogenética que permite un análisis global y comprensible de > 1000 filotipos intestinales. Los autores plantearon la hipótesis de que los lactantes con cólicos mostrarían una microbiota intestinal menos diversa, con una matriz microbiana específica, y que estas diferencias en comparación con los lactantes controles serían observables a temprana edad.


Métodos

Participantes y diseño del estudio
Este estudio es parte de un proyecto longitudinal prospectivo (llamado Estudio Bibo) que investiga las influencias de los factores de cuidados tempranos en el desarrollo de los niños. El diseño de este estudio se describe en detalle en la bibliografía. Todos los padres dieron su consentimiento por escrito y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Ciencias Sociales de la Universidad Radboud de Nijmegen.

Para el estudio actual, los padres de un grupo de 160 lactantes de término sanos recogieron 9 muestras de heces desde el nacimiento hasta ~ los 100 días de vida. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: embarazo de feto único no complicado, sin uso de drogas durante el embarazo, sin problemas físicos maternos pre y postnatales (por ejemplo, diabetes y enfermedades cardíacas) o problemas de salud mental (por ejemplo, depresión mayor), parto a término (≥ 37 semanas) sin mayores complicaciones, y puntuación de Apgar infantil a los 5 minutos normal (≥ 7).

Se recogieron cuatro muestras en el primer mes de vida a los 2 (muestra de meconio), 7, 14, y 28 días y 5 muestras entre los 3 a 5 meses de edad. Las medias (DE) de los días de colección fueron las siguientes: 2.1 (1.0), 6.5 (0.5), 13.8 (0.9), 27.6 (0.7), 83.9 (18.3), 87.9 (18.2), 92.8 (18.3), 100.1 (18.6), y 114.1 (18.2).

Determinación del cólico
Los padres reportaron el llanto a través de un diario de 4 días bien validado a las 6 semanas de vida (41 ± 5 días). Se calculó la media de los minutos diarios de llanto (es decir, la suma del sollozo, las quejas y el llanto inconsolable). Los criterios para cólico se cumplieron en el 25,4% del grupo (es decir, criterio de Wessel modificado para cólico: llanto por un promedio de > 180 minutos por día durante los 4 días del diario). A partir del grupo de niños para los cuales estaba disponible una serie completa de muestras de heces (N = 106, 24,7% cumpliendo los criterios para cólico), se seleccionaron los 12 niños con los niveles más altos de llanto diario y los 12 con los niveles más bajos de llanto diario.

Los dos grupos mostraron grandes diferencias en el tiempo diario dedicado a llorar. A pesar del llanto excesivo en uno de los grupos, los niños eran saludables y la cohorte fue representativa de los lactantes nacidos normalmente en un país occidental con bajo uso de antibióticos. Los problemas de salud más relevantes durante el período de estudio fueron los siguientes: uso de antibióticos (un lactante control), varicela (un lactante con cólicos), y  hospitalización por fractura durante una semana (un lactante control).

Extracción de ADN fecal y análisis de microarray filogenético
Las muestras de heces fueron recogidas por los padres en los hogares y almacenadas a -20° C. Las muestras se transportaron en refrigeradores con cartuchos de congelación o hielo seco para su posterior procesamiento. Se extrajo el ADN total de la materia fecal mediante un procedimiento repetitivo utilizando un protocolo modificado del Kit QiaAmpDNA Mini Stool (Qiagen, Hilden, Alemania). El análisis posterior del ARN ribosomal (ARNr) 16S de los amplicones bacterianos mediante el Chip de tracto intestinal humano (HITChip) se realizó por duplicado.

El HITChip es un microarray filogenético completo y altamente reproducible que permite la elaboración de perfiles paralelos y el análisis semicuantitativo de 1140 filotipos que representan todos los principales fila intestinales agrupados en 131 taxones según género descriptos para la microbiota intestinal humana. Este HITChip de alto rendimiento ha sido evaluado comparativamente con pirosecuenciación ultra-profunda de ARNr 16S y secuenciación paralela de nueva generación de metagenomas intestinales. Estas lecturas taxonómicas están relacionadas con una reciente revisión de la microbiota intestinal humana y se han descripto en detalle.

La hibridación del microarray HITChip se consideró satisfactoria si 2 hibridaciones independientes para cada muestra tenían una correlación > 95% (correlación de Pearson). Los microarrays HITChip mostraron un rango dinámico de > 10000 veces, y se utilizaron > 200 lecturas de microarray independientes en este estudio. Se utilizó el método de varianza mínima de Ward  para la generación de un agrupamiento jerárquico de los perfiles de la sonda microbiota total, mientras que la distancia matriz entre las muestras se basó en correlaciones completas de observación. La cuantificación de las bacterias totales por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real se realizó como se describió previamente.

Análisis de datos
La estabilidad de la composición de la microbiota total se valoró calculando la correlación de ventana móvil de Pearson entre las señales de hibridación transformadas a logaritmo para 3699 sondas HITChip únicas obtenidas por pares de 2 muestras consecutivas en el tiempo.

La diversidad de la microbiota total o de sus subgrupos se evaluó mediante el cálculo del índice de diversidad recíproco de Simpson (1/D). La diversidad se calculó a nivel de la sonda HITChip como se detalló previamente. Para evaluar la significancia de las diferencias entre el cólico y la microbiota control, se realizaron pruebas t de Student de 2 colas.

La prueba de rangos signados de Wilcoxon corregida para tasas de falso descubrimiento por el método de Benjamini y Hochberg se aplicó para determinar las diferencias significativas de cada grupo individual a nivel del género entre los grupos de estudio.

Para los análisis estadísticos multivariados, se utilizó el software CANOCO para Windows 4,5 (Wageningen, Países Bajos). Se utilizó un análisis de redundancia para evaluar las correlaciones entre los grupos microbianos detectados por el análisis HITChip y las características de la muestra. Las señales de hibridación transformadas en logaritmo de 131 grupos filogenéticos según género dirigidas por el HITChip se utilizaron como variables biológicas.

Como variables de confusión ambientales se incluyeron la lactancia materna (semanas), el sexo, el peso al nacer, el parto en el hogar versus parto hospitalario, la edad de muestreo en días y el llanto (lactantes con cólicos o lactantes control). Se utilizó el Procedimiento de Permutación de Monte Carlo para evaluar la importancia de la variación en los grandes conjuntos de datos.


Resultados

Características de los lactantes con cólicos y controles
Los 12 lactantes con cólicos y los 12 lactantes control mostraron distribución por sexo, peso al nacer, lugar y tipo de parto y duración de la lactancia materna muy similares. Se obtuvieron 9 muestras de heces de todos los lactantes.

Perfiles filogenéticos, agrupamiento temporal, y análisis de la composición de la microbiota  fecal total
Seis de las 216 muestras fecales totales no contuvieron suficiente material para su análisis. El ADN total se recuperó fácilmente de las 210 muestras restantes, pero a partir del meconio el recuento total de bacterias en base al análisis mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa fue generalmente 100 a 1000 veces menor que el de las otras muestras.

Posteriormente, el total de los genes ARNr 16S se amplificaron a partir del ADN extraído y se etiquetaron e hibridizaron al microarray filogenético con 3699 sondas de oligonucleótidos HITChip distintas. Todas las muestras fueron analizadas dos veces, y en todos los casos se obtuvo una alta reproducibilidad (coeficiente de Pearson > 95%), lo que acredita la veracidad del enfoque de alto rendimiento utilizado. Por otra parte, la agrupación jerárquica reveló grandes semejanzas entre las muestras fecales del mismo lactante a excepción de las muestras de meconio, que a menudo se agruparon todas juntas (datos no mostrados). Típicamente, tal agrupación sin supervisión expuso un ordenamiento temporal apropiado de las muestras, con la muestra de meconio siendo la más diferente.

 

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