Efecto secretolítico y bronquiolítico de la Alfa-Hederina

Introducción

En los pacientes con enfermedades respiratorias caracterizadas por la hipersecreción de moco viscoso y por tos, los estudios clínicos acerca del uso de extractos de las hojas de hiedra –Hedera helix– han mostrado una mejoría importante en estos individuos. Asimismo, el producto induciría cambios espirométricos favorables y broncodilatación. Además, las saponinas del extracto ejercen un efecto antibacteriano. Estas son el principio activo y se las utiliza para la estandarización de este producto natural. Se estima que alrededor del 10% del extracto alcohólico de hiedra consiste en una mezcla compleja de saponinas; el hederacósido C sería la más importante. Posiblemente la actividad expectorante de las saponinas está relacionada con la estimulación refleja de las glándulas bronquiales, desde la mucosa gástrica y a través de las vías parasimpáticas. Sin embargo, este mecanismo no explica el efecto broncodilatador que se comprueba en modelos experimentales de obstrucción bronquial inducida por el factor activador de plaquetas. Los resultados de los trabajos efectuados sugieren que el extracto de hojas de hiedra ejerce una actividad simpaticomimética que podría explicar el efecto secretolítico y bronquiolítico.

En este artículo, los autores analizaron los efectos de las principales saponinas del extracto de H. helix sobre la regulación del receptor beta2 adrenérgico. Mediante estudios de imágenes en células vivas y espectroscopia de correlación de fluorescencia (ECF), analizaron la dinámica de los receptores beta2 adrenérgicos; también, determinaron los niveles intracelulares de adenosinmonofosfato cíclico (AMPc), luego de la ocupación de los receptores.

Procedimientos experimentales

Los autores evaluaron la síntesis, la identidad y la unión del arterenol marcado con el colorante fluorescente Alexa 532 (Alexa-NA) sobre los receptores beta₂ adrenérgicos (RbA). En los experimentos se utilizaron células de diversas líneas: línea A549 de células de cáncer humano, incubadas en medio RPMI 1640, evaluadas con ECF; líneas celulares de riñón humano HEK293 y células de músculo liso de la vía aérea humana (HASM).

Las células HEK293 fueron sometidas a transfección con un plásmido que codifica el RbA unido a una proteína fluorescente verde (RbA-PF). Se analizó la expresión del RbA en la superficie de células incubadas con Alexa-NA y en células tratadas previamente durante 24 horas con alfa-hederina, hederacósido C o hederagenina 1 µM.

Para el ensayo de la AMPc en células adherentes se utilizó un equipo comercial. Un día después de la siembra, las células se incubaron durante 24 horas con alfa-hederina, hederacósido C o hederagenina 1 µM. Para los experimentos de internalización, las células fueron incubadas durante 20 minutos con terbutalina 1 µM. Todas las mediciones se realizaron a 20° C.

Antes de la determinación de los niveles intracelulares de AMPc, las células se trataron con 10 µM de forscolina/terbutalina o con solución fosfato 10 µM a pH 7.4 durante 10 minutos a 37° C. La fluorescencia se midió con un lector de microplacas GENios luego de aplicar una longitud de onda de excitación de 530 nm y una longitud de onda de emisión de 610 nm.

El comportamiento de difusión tridimensional de los complejos RbA-PF en todos los experimentos de ECF (valores promedio y desviación estándar de 6 experimentos independientes) se conoció con una fórmula matemática. La significación estadística se comprobó con un modelo ANOVA (se consideraron significativos cuando el valor de p fue < 0.05). En los experimentos de unión al ligando, las células A549 fueron tratadas con Alexa532-NA 5 nM durante 15 minutos, antes de las determinaciones de ECF. En los experimentos de saturación se emplearon concentraciones de 2 a 200 nM.

Resultados

La influencia de la alfa-hederina, del hederacósido C y de la hederagenina sobre la regulación celular se conoció mediante estudios de internalización de los complejos RbA-PF en células HEK293 transfectadas. La estimulación con terbutalina 1 µM –un agonista beta2 adrenérgico específico– se asoció con una internalización endocítica importante de los receptores ocupados, a los 20 minutos. Respecto de las células control, las células estimuladas con terbutalina presentaron vesículas intracelulares amplias (endosomas precoces positivos para los complejos RbA-PF). La preincubación con alfa-hederina 1 µM durante 24 horas inhibió la internalización del receptor, incluso después del tratamiento de las células con terbutalina 1 µM durante 20 minutos. En comparación con el control positivo, en las células tratadas con alfa-hederina no se observaron vesículas intracelulares. Aunque las otras dos saponinas son similares estructuralmente a la alfa-hederina, ninguna de ellas influyó sobre la internalización de los receptores beta2 adrenérgicos ocupados.

El efecto inhibitorio de la alfa-hederina sobre la dinámica de los receptores se confirmó en experimentos en biomembranas de células A549, mediante ECF. Luego de la incubación de las células A549 con Alexa-NA 5 nM durante 15 minutos, el rayo láser se enfocó sobre la superficie superior de la membrana. Las fluctuaciones en la intensidad de la fluorescencia se midieron cada 60 segundos. El análisis de la curva de autocorrelación reveló una constante de tiempo de difusión rápida de 1.4 ms y una constante de tiempo de difusión lenta de 34.7 ms. Por el contrario, la constante de difusión libre del Alexa-NA fue de 0.060 ms. La unión total fue de 33%.