Detección de astrovirus MLB1 en niños

Introducción 

Los Astrovirus son agentes virales capaces de infectar diferentes huéspedes, pavos, pollos, vacas, ovejas, perros, gatos, ciervos, patos, murciélagos, incluidos los humanos.

Existen 8 serotipos humanos conocidos, relacionados desde el punto de vista genético. Estos virus suelen manifestarse en humanos con diarrea de 2 a 4 días de duración. Los más comúnmente afectados son niños menores de dos años, ancianos e inmunosuprimidos. Los estudios epidemiológicos hasta ahora presentados sugieren que los serotipos 1 y 8 son responsables de más del 10% de los casos de diarrea aguda no bacteriana. 

Recientemente, en Australia, se identificó un astrovirus altamente divergente respecto de los anteriormente descriptos denominado AstV-MLB1, el virus se identificó en heces de un niño de 3 años. El genoma de este nuevo virus fue posteriormente secuenciado y caracterizado. No ha habido reportes del AstV-MLB1 posterior al del caso índice.

Objetivo

Determinar la prevalencia de este Asta-MLB1 en heces estudiadas por transcriptaza reversa – reacción en cadena de la polimerasa (TR-PCR) de una muestra proveniente de un hospital infantil en Missouri (pacientes pediátricos).

Estudio

Todas las muestras de heces enviadas para cultivo bacteriano (coprocultivo) en el laboratorio de microbiología del hospital de niños de St. Louis (Missouri) fueron analizadas para AstV-MLB1.

El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Washington. Las muestras fueron recolectadas entre enero y mayo de 2008.

Las heces fueron diluidas en un buffer de fosfatos en una proporción 1:6, el ácido nucleico fue extraído de una toma de 200μL de la suspensión por un sistema automatizado de extracción de ácido nucleico.

Se utilizaron los primers descriptos previamente para astrovirus (Mon269 y Mon270) para determinar la frecuencia de los serotipos humanos 1-8. Sin embargo, la amplia divergencia genética del AstV-MLB1 provoca que estos primers no sean capaces de amplificar el serotipo en estudio. Dado que el AstV-MLB1 podría representar una nueva agrupación de astrovirus que podrían además incluir varios subtipos, los autores diseñaron primers específicos para regiones fijas del genoma de AstV-MLB1 para maximizar la probabilidad de detectar cualquier variante del virus e incluso otros astrovirus.

Los autores identificaron regiones conservadas mediante el uso de secuencias del AstV-MLB1, posteriormente la secuencia de nucleótidos correspondiente fue alineada para definir la región más conservada. A partir de estas pruebas se identificaron dos regiones para las cuales se crearon dos primers específicos. Estos fueron validados para detectar AstV-MLB1 como los astrovirus humanos previamente descriptos. Según los autores, en teoría, bajo estricta condición experimental estos primers (SF0073 y SF0076) podrían identificar todos los astrovirus tanto humanos como animales.

Las muestras que resultaron positivas con los primers SF0073 y SF0076 fueron luego testeadas con 2 primers en paralelo para evaluar si se trataban de los serotipos conocidos (1-8) o del AstV-MLB1.